تقييم فعالية مركب الاختبار المضاد للفيروسات من خلال فحص التعطيل الفيروسي

الملخص

المصدر: Tai، C. et al. ، فحوصات الدخول الفيروسي المبكر لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو مقايسة التعطيل الفيروسي ، ويعرض تقييم تأثير العوامل المضادة للفيروسات على الجسيمات الفيروسية.

البروتوكول

1. فحص التعطيل الفيروسي

ملاحظة: يتم سرد أمثلة على فترة الحضانة والجرعة الفيروسية للفيروسات المختلفة في الشكل 1 أ. يمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

1. قم ببذور Huh-7.5 خلية في صفيحة مكونة من 96 بئرا (1 × 10⁴ خلايا لكل بئر) وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ O / N للحصول على طبقة أحادية.
2. احتضان مركبات الاختبار أو الضوابط (التركيزات النهائية هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ الصلصال الصلصال = 50 ميكرومتر ؛ الهيبارين = 1,000 ميكروغرام / مل ؛ DMSO = 1٪) مع جزيئات فيروس التهاب الكبد C عند 37 درجة مئوية (الشكل 1 أ ، "طويل المدى") بنسبة 1: 1. على سبيل المثال ، إلى لقاح فيروس 100 ميكرولتر يحتوي على 1 × 104 FFU ، أضف 100 ميكرولتر من تخفيف عمل CHLA 100 ميكرومتر. ينتج عن هذا علاج CHLA بتركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر.
3. تمييع خليط الفيروس والأدوية إلى تركيز "علاجي فرعي" (غير فعال) لمركبات الاختبار. على سبيل المثال ، يبلغ التركيز غير الفعال ل CHLA و PUG ضد HCV 1 μM31. لذلك ، يتطلب ذلك تخفيفا بمقدار 50 ضعفا لخليط الفيروس والأدوية والذي يمكن تحقيقه باستخدام 9.8 مل من الوسط القاعدي (وسط زراعة الخلايا بنسبة 2٪ FBS).
   ملاحظة: يمنع التخفيف إلى التركيز العلاجي الفرعي التفاعل الكبير بين مركبات الاختبار وسطح الخلية المضيفة ويسمح بفحص تأثير العلاج على الفيروسات الخالية من الخلايا. لاحظ أن هذا التخفيف يعتمد على استجابة الجرعة المضادة للفيروسات لمركبات الاختبار ضد العدوى الفيروسية المعينة ويتم تحديده قبل إجراء هذا الفحص المحدد.
4. للمقارنة ، قم بخلط الفيروس مع مركبات الاختبار وتخفيفه على الفور (بدون فترة حضانة) إلى تركيز علاجي فرعي قبل الإصابة (الشكل 1 أ ، "قصير المدى").
5. أضف 100 ميكرولتر من خليط دواء فيروس التهاب الكبد C المخفف إلى الطبقة الأحادية لخلية Huh-7.5 (كمية الفيروس الآن عند 1 × 10² FFU ؛ وزارة الداخلية النهائية = 0.01) واحتضانها لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية للسماح بامتصاص الفيروس.
6. بعد الإصابة ، قم بإزالة اللقاح المخفف وغسل الآبار برفق ب 200 ميكرولتر من PBS مرتين.
   ملاحظه: قم بإجراء الغسيل برفق لتجنب رفع الخلايا.
7. ضع 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي على كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
8. تحليل العدوى الناتجة عن طريق فحص المادة الطافية لنشاط لوسيفيراز.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تعطيل الالتهابات الفيروسية بواسطة مركبات الاختبار CHLA و PUG. عولجت فيروسات مختلفة بمركبات الاختبار لفترة طويلة (تحتضن لمدة 1.5 - 3 ساعات قبل المعايرة بالتحليل الحجمي ؛ قضبان رمادية فاتحة) أو لفترة قصيرة (مخففة على الفور ؛ قضبان رمادية داكنة) عند 37 درجة مئوية قبل التخفيف إلى التركيز العلاجي الفرعي والتحليل اللاحق للعدوى على الخلايا المضيفة المعنية. (أ) مخططات الت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM جيبكو 11995-040 FBS جيبكو هاتف: 26140-079 البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15070-063 الأمفوتريسين ب جيبكو 15290-018 DMSO سيغما د5879 طقم فحص السموم في المختبر ، XTTbased سيغما TOX2 PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو 10010023 قارئ اللوحة الدقيقة الترمو: العلمية 89087-320 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الترمو: العلمية 75002420 طقم فحص BioLux Gaussia luciferase نيو إنجلاند بيولابيس E3300L مقياس الإضاءة بروميجا جلوماكس -20/20 سترات الصوديوم ، ثنائي هيدرات سيغما 71402 كلوريد البوتاسيوم سيغما ص 5405