مقايسة التعلق الفيروسي لفحص المركبات المضادة للفيروسات

الملخص

المصدر: Tai ، C. et al. ، فحوصات الدخول الفيروسي المبكر لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات. J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو مقايسة ارتباط فيروسي لفحص المركبات المضادة للفيروسات. باستخدام فيروس التهاب الكبد C المعدل وراثيا ولوسيفيراز ، فإنه يقيم التأثيرات المثبطة على الارتباط الفيروسي ، كما يتضح من انخفاض شدة الضوء في الآبار المعالجة المشتركة مقارنة بالآبار المعالجة بالفيروس وحده.

البروتوكول

ملاحظة: تأكد من أن جميع الإجراءات التي تنطوي على زراعة الخلايا والعدوى الفيروسية تتم في أغطية السلامة البيولوجية المعتمدة المناسبة لمستوى السلامة البيولوجية للعينات التي يتم التعامل معها. لغرض وصف البروتوكولات ، يتم استخدام فيروس التهاب الكبد C (HCV) الموسوم بمراسل Gaussia luciferase كفيروس نموذجي. في سياق النتائج التمثيلية ، يتم استخدام مركبات حمض الكيبولوجيك (CHLA) و punicalagin (PUG) كمضادات فيروسات مرشحة تستهدف تفاعلات البروتين السكري الفيروسي مع الجليكوزامينوجليكان على سطح الخلية خلال خطوات الدخول الفيروسية المبكرة. يستخدم الهيبارين ، المعروف أنه يتداخل مع دخول العديد من الفيروسات ، كعلاج إيجابي للتحكم في مثل هذا السياق. للحصول على خلفية أساسية حول تقنيات علم الفيروسات ، وانتشار الفيروسات ، وتحديد عيار الفيروس ، والتعبير عن الجرعة المعدية في وحدات تكوين البلاك (PFU) ، أو وحدات تشكيل التركيز (FFU) ، أو تعدد العدوى (MOI) ، تتم إحالة القارئ إلى المرجع. للحصول على أمثلة سابقة وظروف محسنة مستخدمة للفيروسات الموضحة في النتائج التمثيلية ، تتم إحالة القارئ إلى المراجع بالإضافة إلى التفاصيل المدرجة في الجدول 1 ، الشكل 1 أ.

فئة

1. زراعة الخلايا ، وإعداد المركب ، والسمية الخلوية المركبة

1. قم بتنمية خط الخلايا المعني لنظام الإصابة بالفيروس المراد تحليله (الجدول 1). بالنسبة لفيروس التهاب الكبد C ، قم بزراعة خلايا Huh-7.5 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، و 200 وحدة / مل بنسلين G ، و 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B.
2. قم بإعداد مركبات الاختبار وأدوات التحكم باستخدام المذيبات الخاصة بها: على سبيل المثال ، قم بإذابة CHLA و PUG في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ؛ تحضير الهيبارين في ماء مقطر مزدوج معقم. لجميع التخفيفات اللاحقة ، استخدم وسائط الثقافة
   ملاحظة: التركيز النهائي ل DMSO في العلاجات المركبة للاختبار أقل من 1٪ في التجارب. يتم تضمين 1٪ DMSO كعلاج تحكم سلبي في المقايسات للمقارنة.
3. تحديد السمية الخلوية لمركبات الاختبار (على سبيل المثال ، CHLA و PUG) على الخلايا للعدوى الفيروسية باستخدام كاشف تحديد صلاحية الخلية مثل XTT (2،3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide):
   1. بالنسبة لفيروس التهاب الكبد C ، قم ببذور Huh-7.5 خلايا في صفيحة مكونة من 96 بئرا (1 × 10⁴ خلايا لكل بئر) وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ O / N للحصول على طبقة أحادية.
   2. تطبيق التحكم DMSO (1٪) أو زيادة تركيزات مركبات الاختبار CHLA و PUG (على سبيل المثال 0 و 10 و 50 و 100 و 500 و 500 ميكرومتر) على آبار الاستزراع في ثلاث نسخ.
   3. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، ثم تخلص من الوسط في الطبق واغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين.
   4. أضف 100 ميكرولتر من محلول الفحص من مجموعة فحص السموم في المختبر المستندة إلى XTT إلى كل بئر واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أخرى للسماح بإنتاج فورمازان XTT.
   5. حدد الامتصاص باستخدام قارئ صفيحة دقيقة بطول موجي اختبار يبلغ 492 نانومتر وطول موجي مرجعي يبلغ 690 نانومتر.
   6. احسب النسبة المئوية للخلايا الباقية باستخدام الصيغة التالية: بقاء الخلية (٪) = At / As × 100٪ ، حيث تشير "At" و "As" إلى امتصاص مركبات الاختبار وعلاجات التحكم في المذيبات (على سبيل المثال 1٪ DMSO) ، على التوالي. تحديد تركيز السمية الخلوية بنسبة 50٪ (CC₅₀) لمركبات الاختبار من برنامج تحليلي مثل GraphPad Prism وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

< p class = "jove_title" >2. قراءة العدوى الفيروسية

ملاحظة: تعتمد قراءة العدوى الفيروسية على نظام الفيروس المستخدم ويمكن أن تتضمن طرقا مثل فحوصات البلاك أو قياس إشارات المراسل من الفيروسات الموسومة من قبل المراسل. طريقة الكشف عن عدوى فيروس التهاب الكبد C المبلغة بناء على نشاط مراسل لوسيفيراز موصوفة أدناه.

1. اجمع المواد الطافية من الآبار المصابة وقم بتوضيحها عند 17,000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. امزج 20 ميكرولتر من المادة الطافية للاختبار مع 50 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز من مجموعة فحص Gaussia luciferase وقم بالقياس مباشرة باستخدام مقياس الإضاءة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. التعبير عن عدوى فيروس التهاب الكبد C كسجل₁₀ لوحدات الضوء النسبي (RLU) لتحديد تثبيط الفيروس (٪) وحساب التركيز الفعال بنسبة 50٪ (EC₅₀) لمركبات الاختبار ضد عدوى فيروس التهاب الكبد C باستخدام خوارزميات من برنامج GraphPad Prism وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

3. فحص المرفقات الفيروسية

ملاحظة: يتم سرد أمثلة على فترة الحضانة والجرعة الفيروسية للفيروسات المختلفة في الشكل 1 أ ، "المرفق". يمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

1. قم ببذور Huh-7.5 خلية في صفيحة مكونة من 96 بئرا (1 × 10⁴ خلايا لكل بئر) وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ O / N للحصول على طبقة أحادية.
قم
2. بتبريد الطبقات الأحادية للخلية مسبقا في أطباق عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
3. المعالجة المشتركة للخلايا بلقاح التهاب الكبد C (وزارة الداخلية = 0.01) ومركبات الاختبار أو الضوابط (التركيزات النهائية هي: CHLA = 50 ميكرومتر; الصلصال الصلصال = 50 ميكرومتر ؛ الهيبارين = 1,000 ميكروغرام / مل ؛ DMSO = 1٪) عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال ، إلى لقاح فيروس 90 ميكرولتر يحتوي على 1 × 10² FFU ، أضف 10 ميكرولتر من تخفيف عمل CHLA 500 ميكرومتر. ينتج عن هذا علاج CHLA بتركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر وعدوى بفيروس التهاب الكبد C في وزارة الداخلية = 0.01 على طبقة الخلية أحادية.
   ملاحظة: من المهم إجراء التجربة عند 4 درجات مئوية لأنها تسمح بالارتباط بالفيروس ولكنها تمنع الدخول الذي يحدث بكفاءة أكبر عند 37 درجة مئوية. قم بإجراء إضافة الفيروسات ومركبات الاختبار على الجليد وما يترتب على ذلك من حضانة في ثلاجة 4 درجات مئوية لضمان الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
4. قم بإزالة المادة الطافية واغسل طبقة أحادية الخلية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المثلج البارد مرتين.
   ملاحظة: قم بإجراء الغسيل برفق لتجنب رفع الخلايا.
5. ضع 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي على كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
6. تحليل العدوى الناتجة عن طريق فحص المادة الطافية لنشاط لوسيفيراز كما هو موضح في '2. قراءات العدوى الفيروسية".

< p class = "jove_content" >الجدول 1: نوع الخلية المضيفة للعدوى الفيروسية.يشار إلى نوع الخلية المستخدم لكل نظام عدوى فيروسية موصوف في النتائج التمثيلية. يمكن العثور على تفاصيل إضافية بخصوص الخلايا في المرجع.

فيروس نوع الخلية HCMV هيل فيروس التهاب الكبد C هاه 7.5 DENV-2 فيرو ام تشو سلام RSV HEp-2

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تقييم الأنشطة المضادة للفيروسات لمركبات الاختبار CHLA و PUG ضد الارتباط بالفيروس ودخوله / اندماجه.(أ) يتم عرض الإجراء التجريبي وتركيز الفيروس (PFU/البئر أو وزارة الداخلية) ووقت الإضافة والمعالجة بمركبات الاختبار (الأول والثاني والثالث) لكل فيروس في المخططات والجداول المرتبطة بها. في تحليل ارتباط الفيروس (قضبان رمادية فاتحة) ، تم تبريد طبقات أحادية من أنواع مختلفة من الخلايا مسبقا ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM جيبكو 11995-040 FBS جيبكو هاتف: 26140-079 البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15070-063 الأمفوتريسين ب جيبكو 15290-018 DMSO سيغما د5879 مجموعة فحص السموم في المختبر ، القائمة على XTT سيغما TOX2 PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو 10010023 قارئ اللوحة الدقيقة Bio-Tek Instrument، Inc. ELx800 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الترمو: العلمية 75002420 طقم فحص BioLux Gaussia luciferase نيو إنجلاند بيولابيس E3300L مقياس الإضاءة بروميجا جلوماكس -20/20