مقايسة لتقييم تأثير مركبات الاختبار على دخول الفيروس والاندماج في الخلايا المضيفة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Tai، C.، et al. فحوصات الدخول الفيروسي المبكر لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتقييم العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف خطوات محددة لدخول الفيروس إلى الخلايا المضيفة والاندماج مع الجسيم الداخلي. يتم تحضين الخلايا عند درجة حرارة منخفضة ثم تصاب بفيروس التهاب الكبد C. تسمح درجة الحرارة المنخفضة بالارتباط الفيروسي بالخلايا المضيفة ولكنها تمنع الاستيعاب عن طريق الالتقام الخلوي. يضاف مركب الاختبار المضاد للفيروسات ، ويتم تحضين الخلايا في درجة حرارة فسيولوجية. يسهل هذا التحول إلى درجة حرارة أعلى دخول الفيروس ويسمح بتقييم تأثير مركب الاختبار على اندماج الغلاف الفيروسي مع الجسيمات الداخلية.

البروتوكول

ملاحظة: تأكد من أن جميع الإجراءات التي تنطوي على زراعة الخلايا وعدوى الفيروس يتم إجراؤها في أغطية السلامة البيولوجية المعتمدة المناسبة لمستوى السلامة البيولوجية للعينات التي يتم التعامل معها. لغرض وصف البروتوكولات ، يتم استخدام فيروس التهاب الكبد C الموسوم بمراسل Gaussia luciferase كفيروس نموذجي. في سياق النتائج التمثيلية ، يتم استخدام مركبات حمض الكيبولوجيك (CHLA) و punicalagin (PUG) كمضادات فيروسات مرشحة تستهدف تفاعلات البروتين السكري الفيروسي مع الجليكوزامينوجليكان على سطح الخلية خلال خطوات الدخول الفيروسية المبكرة. يستخدم الهيبارين ، المعروف أنه يتداخل مع دخول العديد من الفيروسات ، كعلاج إيجابي للتحكم في مثل هذا السياق.

فئة

1. زراعة الخلايا ، وإعداد المركب ، والسمية الخلوية المركبة

1. قم بتنمية خط الخلايا المعني لنظام الإصابة بالفيروس المراد تحليله (الجدول 1). بالنسبة لفيروس التهاب الكبد C ، قم بزراعة خلايا Huh-7.5 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، و 200 وحدة / مل بنسلين G ، و 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B.
2. قم بإعداد مركبات الاختبار وأدوات التحكم باستخدام المذيبات الخاصة بها: على سبيل المثال ، قم بإذابة CHLA و PUG في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ؛ تحضير الهيبارين في ماء مقطر مزدوج معقم. لجميع التخفيفات اللاحقة ، استخدم وسائط الثقافة
   ملاحظة: التركيز النهائي ل DMSO في العلاجات المركبة للاختبار أقل من 1٪ في التجارب. يتم تضمين 1٪ DMSO كعلاج تحكم سلبي في المقايسات للمقارنة.
3. تحديد السمية الخلوية لمركبات الاختبار (على سبيل المثال ، CHLA و PUG) على الخلايا للعدوى الفيروسية باستخدام كاشف تحديد صلاحية الخلية مثل XTT (2،3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide):
   1. بالنسبة لفيروس التهاب الكبد C ، قم ببذور Huh-7.5 خلايا في صفيحة مكونة من 96 بئرا (1 × 10⁴ خلايا لكل بئر) وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ O / N للحصول على طبقة أحادية.
   2. تطبيق التحكم DMSO (1٪) أو زيادة تركيزات مركبات الاختبار CHLA و PUG (على سبيل المثال 0 و 10 و 50 و 100 و 500 و 500 ميكرومتر) على آبار الاستزراع في ثلاث نسخ.
   3. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، ثم تخلص من الوسط في الطبق واغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين.
   4. أضف 100 ميكرولتر من محلول الفحص من مجموعة فحص السموم في المختبر المستندة إلى XTT إلى كل بئر واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أخرى للسماح بإنتاج فورمازان XTT.
   5. حدد الامتصاص باستخدام قارئ صفيحة دقيقة بطول موجي اختبار يبلغ 492 نانومتر وطول موجي مرجعي يبلغ 690 نانومتر.
   6. احسب النسبة المئوية للخلايا الباقية باستخدام الصيغة التالية: بقاء الخلية (٪) = At / As × 100٪ ، حيث تشير "At" و "As" إلى امتصاص مركبات الاختبار وعلاجات التحكم في المذيبات (على سبيل المثال 1٪ DMSO) ، على التوالي. تحديد تركيز السمية الخلوية بنسبة 50٪ (CC₅₀) لمركبات الاختبار من برنامج تحليلي مثل GraphPad Prism وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

< p class = "jove_title" >2. قراءة العدوى الفيروسية

ملاحظة: تعتمد قراءة العدوى الفيروسية على نظام الفيروس المستخدم ويمكن أن تتضمن طرقا مثل فحوصات البلاك أو قياس إشارات المراسل من الفيروسات الموسومة من قبل المراسل. طريقة الكشف عن عدوى فيروس التهاب الكبد C المبلغة بناء على نشاط مراسل لوسيفيراز موصوفة أدناه.

1. اجمع المواد الطافية من الآبار المصابة وقم بتوضيحها عند 17,000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. امزج 20 ميكرولتر من المادة الطافية للاختبار مع 50 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز من مجموعة فحص Gaussia luciferase وقم بالقياس مباشرة باستخدام مقياس الإضاءة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. التعبير عن عدوى فيروس التهاب الكبد C كسجل₁₀ لوحدات الضوء النسبي (RLU) لتحديد تثبيط الفيروس (٪) وحساب التركيز الفعال بنسبة 50٪ (EC₅₀) لمركبات الاختبار ضد عدوى فيروس التهاب الكبد C باستخدام خوارزميات من برنامج GraphPad Prism وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

< p class = "jove_title" >3. فحص الدخول الفيروسي / الانصهار

ملاحظة: يتم سرد أمثلة على فترات الحضانة والجرعات الفيروسية للفيروسات المختلفة في الشكل 1 أ "الدخول / الاندماج". يمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

1. قم ببذور Huh-7.5 خليا في صفيحة مكونة من 96 بئرا (1 × 10⁴ خلايا لكل بئر) ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ O / N للحصول على طبقة أحادية.
قم
2. بتبريد الطبقات الأحادية للخلية مسبقا في أطباق عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
3. إصابة الخلايا بفيروس التهاب الكبد C (تعدد العدوى ، وزارة الداخلية = 0.01) عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال ، استخدم لقاح فيروس 100 ميكرولتر يحتوي على 1 × 10² وحدة تشكيل التركيز (FFU).
   ملاحظه: قم بإجراء إضافة اللقاح الفيروسي على الجليد والحضانة التي تلت ذلك في ثلاجة 4 درجات مئوية للحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية ، مما يسمح بالارتباط الفيروسي ولكن لا يسمح بالدخول.
4. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الطبقات الأحادية للخلية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المثلج البارد مرتين.
   ملاحظه: قم بإجراء الغسيل برفق لتجنب رفع الخلايا.
5. معالجة الآبار بمركبات الاختبار أو الضوابط (التركيزات النهائية هي: CHLA = 50 ميكرومتر ؛ الصلصال الصلصال = 50 ميكرومتر ؛ الهيبارين = 1,000 ميكروغرام / مل ؛ DMSO = 1٪) وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال ، أضف 10 ميكرولتر من تخفيف عمل CHLA 500 ميكرومتر إلى 90 ميكرولتر من الوسائط ، واخلط الآبار ومعالجتها ؛ ينتج عن هذا علاج CHLA بتركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومولار
   ملاحظه: يسهل التحول من 4 درجات مئوية إلى 37 درجة مئوية الآن حدث دخول / اندماج الفيروس وبالتالي يسمح بتقييم تأثير مركبات الاختبار على هذه الخطوة بالذات.
6. استنشق المادة الطافية المحتوية على الدواء وإزالة الفيروسات خارج الخلية غير الداخلية إما عن طريق الغسيل ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسترات (50 ملي سيترات الصوديوم ، 4 ملي كلوريد البوتاسيوم ، الرقم الهيدروجيني 3.0) أو PBS. ضع 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
7. تحليل العدوى الناتجة عن طريق فحص المادة الطافية لنشاط لوسيفيراز كما هو موضح في '2. قراءات العدوى الفيروسية".

النتائج

الجدول 1: نوع الخلية المضيفة للعدوى الفيروسية. يشار إلى نوع الخلية المستخدم لكل نظام عدوى فيروسية موصوف في النتائج التمثيلية.

فيروس نوع الخلية HCMV هيل فيروس التهاب الكبد C هاه 7.5 DENV-2 فيرو ام تشو س...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM جيبكو 11995-040 FBS جيبكو هاتف: 26140-079 البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15070-063 الأمفوتريسين ب جيبكو 15290-018 DMSO سيغما د5879 مجموعة فحص السموم في المختبر ، القائمة على XTT سيغما TOX2 PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو 10010023 قارئ اللوحة الدقيقة Bio-Tek Instrument، Inc. ELx800 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الترمو: العلمية 75002420 طقم فحص BioLux Gaussia luciferase نيو إنجلاند بيولابيس E3300L مقياس الإضاءة بروميجا جلوماكس -20/20 سترات الصوديوم ، ثنائي هيدرات سيغما 71402 كلوريد البوتاسيوم سيغما ص 5405