$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير خلايا الإشريكية القولونية للاختبار
- للحصول على تعليق الخلية المطلوب ، انقل 1 مل من المخزون المستزرع إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.
- أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا. قم بتشغيل تعليق الخلية لمدة 5 دقائق. انقل معلق الخلية إلى صندوق ثلج لمدة 5 دقائق.
- قم بتشغيل تعليق الخلية لمدة 5 دقائق أخرى.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استخدم المادة الطافية للاختبار (10 ميكرولتر).
< p class = "jove_title" >
2. اختبار عباد الشمس
- في أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل ، اغسل الأنبوب مسبقا عن طريق إضافة ودوامة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل (RB) في أنبوب الطرد الدقيق والتخلص من المخزن المؤقت.
- انقل 15 ميكرولتر من EC1 المجمع إلى أنبوب الطرد الدقيق المغسول.
- اغسل الخرزات المغناطيسية عن طريق وضع أنبوب الطرد الدقيق على رف مغناطيسي. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينات. قم بإزالة أنبوب الطرد الدقيق من الرف ، وأضف 100 ميكرولتر من RB ، وأعد تعليق الخرز المغناطيسي بعناية.
- اغسل الميغابايت مرتين أخريين بتكرار الخطوة 2.3.
- ضع أنبوب الطرد الدقيق مرة أخرى على الرف المغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأضف عينة الإشريكية القولونية سعة 10 ميكرولتر المحضرة من الخطوة 1.3.
- امزج العينة والخرز المغناطيسي بعناية عن طريق النقر برفق على أنبوب الطرد الدقيق.
- احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- أضف إلى التفاعل 90 ميكرولتر من ddH2O وضع أنبوب الطرد الدقيق على رف مغناطيسي.
- بعد حوالي 3 دقائق من الفصل المغناطيسي ، انقل بعناية 85 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 0.5 مل. اسحب المادة الطافية ببطء لتجنب جمع أي حبات مغناطيسية.
- أضف إلى أنبوب الطرد الدقيق أعلاه 15 ميكرولتر من 0.04٪ فينول أحمر و 100 ميكرولتر من محلول الركيزة.
- التقط صورة فوتوغرافية على فترات زمنية محددة لتسجيل تغير اللون.
ملاحظه: يمكن أيضا مراقبة التغيير في الأس الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني مع قطب كهربائي دقيق. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للبدء حوالي 5.2-5.5 (المحلول أصفر). إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكن تعديل المحلول عن طريق إضافة 1 ملي مولار من الأسيتات عازلة درجة الحموضة 5.0).