اختبار مراسل لوسيفيراز لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة بفيروس الجدري

الملخص

المصدر: Dhungel ، P. ، et al. في المختبر ، تم نسخ اختبار مراسل Luciferase المستند إلى الحمض النووي الريبي لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة بفيروس الجدري. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو اختبارا لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة بفيروس الجدري. تم نقل الخلايا غير المصابة والمصابة بالفيروس مع mRNAs التي تشفر ليراع لوسيفيراز (Fluc) و Renilla luciferase (Rluc) ، مع احتواء Fluc mRNA على تسلسل زعيم 5 'Poly (A). عند إضافة ركائز مضيئة بيولوجيا على الخلايا المحللة ، قم بقياس الإشارة من كل من اللوسيفيراز لتحديد الميزة الانتقالية ل Fluc mRNA في الخلايا المصابة بالفيروسات ، والتي يمنحها تسلسل الرائد.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. نقل mRNA إلى الخلايا

1. بذور خلايا HeLa في صفيحة 24 بئرا (لتكون حوالي ~ 80-90٪ ملتقية في اليوم التالي) وتحتضن بين عشية وضحاها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. إصابة خلايا HeLa بفيروس اللقاح (VACV) في تعدد العدوى (MOI) من 5 أو الاحتفاظ بخلايا HeLa غير المصابة للمقارنة.
   ملاحظه: وزارة الداخلية هي عدد الجسيمات الفيروسية المعدية لكل خلية.
3. وزارة الداخلية ل X = {[(عدد الخلايا * X) / عيار الفيروس] * 1000} ميكرولتر من الفيروس لكل 1 مل وسط.
4. بعد h المطلوب بعد الإصابة (hpi) (في هذه التجربة عند 10-12 hpi) ، transfect mRNA (500 ng من إجمالي mRNA لكل بئر من 24 بئر ألواح بئر) باستخدام كاشف تعداء الدهون الكاتيوني كما هو موضح في الشكل 1C.
   1. بالنسبة لبئر واحد من صفيحة 24 بئرا ، امزج 480 نانوغرام من 12A تسلسل يحمل اليراع لوسيفيراز (12A-Fluc) mRNA و 20 نانوغرام من تسلسل Kozak الذي يحمل Renilla luciferase (Kozak-Rluc) mRNA في أنبوب واحد للطرد المركزي الدقيق. في أنبوب طرد مركزي دقيق آخر ، أضف 1.1 ميكرولتر من كاشف تعداء الدهون الكاتيونية.
   2. أضف 55 ميكرولتر من وسط المصل المختزل في كلا الأنبوبين. تخلط وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أضف 55 ميكرولتر كاشف تعداء دهني كاتيوني يحتوي على وسط مصل منخفض في أنبوب يحتوي على mRNA mRNA.
   4. تخلط برفق ولكن جيدا ، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   5. أثناء الحضانة ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا وأضف 400 ميكرولتر من وسط المصل المختزل لكل بئر من ألواح 24 بئرا.
   6. بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الخليط بالتنقيط وبالتساوي إلى بئر واحد من 24 بئرا.

2. قياس أنشطة Luciferase

1. بعد خمس ساعات من التعداء المشترك ل 12A-Fluc و Kozak-Rluc mRNA ، تقيس نشاط لوسيفيراز باستخدام نظام فحص لوسيفيراز قادر على إجراء فحصين للمراسلين (على سبيل المثال ، مجموعة فحص مراسل لوسيفيراز المزدوج).
2. قم بإزالة وسط المصل المخفض وتحلل الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولتر 1x محلول تحلل ، وهو أحد مكونات مجموعة فحص لوسيفيراز.
3. بعد 10 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، اجمع المحللة عن طريق التخلص من الخلايا ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
4. الطرد المركزي المحللة عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحطام خلايا الحبيبات.
5. أضف 30 ميكرولتر من المادة الطافية في صفيحة فحص بيضاء غير شفافة الجدران مكونة من 96 بئرا ذات قاع صلب.
6. قم بقياس اللمعان المزدوج باستخدام مجموعة مقايسة لوسيفيراز ومقياس إضاءة قارئ الألواح متعدد الأوضاع.
7. إجراء القياس باستخدام وظيفة الحركية (على أساس كل بئر) باستخدام الإعدادات المبينة في الجدول 1.
   ملاحظه: يمكن أيضا أخذ القراءة باستخدام مقياس الإضاءة اليدوي. أضف حجما متساويا من المحللة والركيزة ل Fluc في كوفيت. انتظر لمدة 2 ثانية وقم بالقياس لمدة 10 ثوان باستخدام مقياس الإضواء. بعد قياس Fluc ، أخرج الكوفيت بسرعة من مقياس الإضاءة وأضف حجما متساويا من الركيزة ل Rluc يدويا. مرة أخرى ، انتظر لمدة 2 ثانية وقم بالقياس لمدة 10 ثوان باستخدام مقياس الإضواء.
8. قم بتصدير بيانات قراءة اللمعان إلى تنسيق ملف مرغوب فيه.
9. حدد معدل الترجمة النسبي من 12A-Fluc mRNA في خلايا HeLa غير المصابة والمصابة ب VACV بقسمة قيمة Fluc على قيمة التحكم الداخلي Rluc.
   ملاحظة: يوضح الشكل 2 التحليل خطوة بخطوة للبيانات الأولية للحصول على نشاط Fluc النسبي.

الجدول 1: إعدادات قياس لوسيفيراز - خطوات قياس لوسيفيراز بالحجم أو الوقت الموصى به.

الخطوات الحجم / الوقت حقن ركيزة فحص لوسيفيراز (Fluc): 30 ميكرولتر وقت الانتظار / الحضانة: 2 ثانية قياس التلألؤ (Fluc): 10 ثانية ركيزة Stop & Glo (Rluc): 30 ميكرولتر وقت الانتظار / الحضانة: 2 ثانية قياس التلألؤ (Rluc): 10 ثانية

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخليق الحمض النووي الريبي المرسال وتعداده. (أ) تخطيطي للنسخ في المختبر. يتم تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على جين لوسيفيراز في اتجاه مجرى النهر من 5'-UTR محل الاهتمام ويتم استخدام محفز T7 كقالب. يتم تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 في المحفز ويضيف الريبونوكليوتيدات ، الموضحة باللون الأبيض ، من اتجاه 5 إلى 3. بمجرد أ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كورنينج 96 بئر نصف منطقة صفيحة بوليسترين بيضاء مسطحة القاع كورنينج 3693 صفيحة بيضاء غير شفافة 96 بئر ذات قاع صلب نظام فحص مراسل Luciferase المزدوج بروميجا [إ1960] مجموعة فحص لوسيفيراز المزدوجة (DLAK) GloMax Navigator Microplate Luminometer بروميجا GM2010 يشار إليه باسم مقياس الإضاءة لقارئ الألواح متعدد الأوضاع ليبوفيكتامين 2000 ثيرمو فيشر العلمي 11668019 كاشف تعداء الدهون الموجبة أوبتي-ميم ثيرمو فيشر العلمي 31985070 وسائط مصل مخفضة