مقالة منهجية

طريقة صفيحة ميكروتيتر لتقييم الحد الأدنى للتركيز المثبط للمضاد الحيوي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ketelboeter ، L. M. ، et al. طرق لتثبيط إنتاج البيوميلانين البكتيري وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو طريقة قائمة على لوحة الميكروتيتر لتحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للمضادات الحيوية للاختبار ضد البكتيريا. عند إضافة تعليق من العامل الممرض البكتيري Pseudomonas aeruginosa إلى صفيحة ميكروتيتر تحتوي على تخفيفات متسلسلة لمضاد حيوي اختبار ، ومثبط لإنتاج البيوميلانين بواسطة البكتيريا ، يتم قياس الكثافة البصرية للآبار لحساب الحد الأدنى من التركيز المثبط للمضاد الحيوي ، وتأثير مثبط إنتاج البيوميلانين على حساسية البكتيريا بالمضادات الحيوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. فحص الحد الأدنى للتركيز المثبط للمضادات الحيوية (MIC) في ألواح 96 بئرا

  1. قم بإعداد مزارع ليلية للسلالات ليتم اختبارها في LB (Luria-Bertani) مع وبدون NTBC (2-[2-nitro-4- (trifluoromethyl) benzoyl] -1،3-cyclohexanedione).
    ملاحظه: يتم وصف هذا البروتوكول باستخدام المستوى التمثيلي ل 300 ميكرومولار NTBC.
    1. أضف 300 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل رطل. أضف حجما مكافئا من السيارة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO) إلى 2 مل رطل لحالة عدم وجود NTBC.
    2. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، قم بتلقيح الأنابيب بمستعمرة واحدة معزولة من البكتيريا. ستكون هناك ثقافة واحدة مع NTBC وثقافة واحدة بدون NTBC لكل سلالة. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التهوية باستخدام دوار زراعة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  2. في اليوم التالي ، قم بعمل حلول رئيسية LB + NTBC و LB + DMSO لإعداد مقايسة الميكروفون. أضف NTBC بتركيز 600 ميكرومتر حيث سيتم تخفيفه مرتين عند إضافة اللقاح ، مما ينتج عنه تركيز نهائي قدره 300 ميكرومتر.
    1. لاختبار مضاد حيوي واحد لسلالة واحدة ، أضف 600 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل رطل واخلطه لصنع محلول NTBC الرئيسي. أضف حجما مكافئا من السيارة (DMSO) إلى 2 مل رطل واخلطه لعمل الحل الرئيسي بدون NTBC. استخدم هذه الحلول لإنشاء حلول مخزون المضادات الحيوية وكذلك لإعداد سلسلة التخفيف في ألواح 96 بئرا.
      ملاحظه: ستنتج تركيبات المحلول الرئيسية حلولا إضافية لمراعاة أخطاء سحب العينات. يمكن توسيع نطاق الحلول الرئيسية أو تقليلها حسب الحاجة اعتمادا على عدد المضادات الحيوية والسلالات التي تم اختبارها.
  3. تحضير محاليل المضادات الحيوية في الحلول الرئيسية LB + NTBC أو LB + DMSO.
    ملاحظه: يجب أن يكون تركيز المضادات الحيوية في هذه المحاليل ضعف التركيز النهائي المطلوب. يجب عمل محلول كاف لنقل 100 ميكرولتر إلى أربعة آبار في صفيحة 96 بئرا.
    1. تحضير محلول مخزون الجنتاميسين +/- NTBC عند 64 ميكروغرام / مل. لعمل هذا المحلول ، أضف 0.288 ميكرولتر من مخزون الجنتاميسين (100 مجم / مل) إلى 450 ميكرولتر من LB + NTBC أو LB + محلول DMSO.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز الجنتاميسين ل Pseudomonas aeruginosa PAO1 هو 32 ميكروغرام / مل.
    2. اصنع محلول مخزون الكاناميسين +/- NTBC عند 256 ميكروغرام / مل. لعمل هذا الحل ، أضف 3.84 ميكرولتر من مخزون الكاناميسين (30 مجم / مل) إلى 450 ميكرولتر من الحلول الرئيسية للرطل + NTBC أو LB + DMSO.
      ملاحظه: الحد الأقصى لتركيز الكاناميسين ل P. aeruginosa PAO1 هو 128 ميكروغرام / مل.
    3. تحضير محلول مخزون توبرامايسين +/- NTBC بمعدل 8 ميكروغرام / مل. لعمل هذا الحل ، أضف 0.36 ميكرولتر من مخزون التوبرامايسين (10 مجم / مل) إلى 450 ميكرولتر من الحلول الرئيسية للرطل + NTBC أو LB + DMSO.
      ملاحظه: بالنسبة إلى P. aeruginosa PAO1 ، يبلغ الحد الأقصى لتركيز التوبراميسين 4 ميكروغرام / مل
      ملاحظه: يمكن تعديل المضادات الحيوية والتركيزات للبكتيريا المراد اختبارها.
  4. أضف 100 ميكرولتر من كل محلول مضاد حيوي 2x إلى أربعة آبار في طبق 96 بئرا. ضع هذه الحلول في الصف أ. على سبيل المثال ، يجب وضع الجنتاميسين في A1 إلى A4 ، ويجب وضع الكاناميسين في A5 إلى A8 ، ويجب وضع التوبرامايسين في A9 إلى A12. انظر الشكل 1 أ للحصول على رسم تخطيطي لإعداد لوحة 96 بئرا.
    ملاحظه: يمكن اختبار العديد من المضادات الحيوية في صفيحة واحدة ، ولكن يجب اختبار سلالة واحدة فقط لكل لوحة للقضاء على احتمالية التلوث المتبادل من السلالات الأخرى.
  5. أضف 50 ميكرولتر من الحل الرئيسي LB + NTBC أو LB + DMSO إلى الصفوف B إلى H من اللوحة المكونة من 96 بئرا. تأكد من أن اللوحة الواحدة هي LB + NTBC واللوحة الواحدة هي LB + DMSO. انظر الشكل 1 أ.
    1. استخدم LB + NTBC للمضادات الحيوية في LB + NTBC. استخدم LB + DMSO للمضادات الحيوية في LB + DMSO.
  6. باستخدام ماصة دقيقة، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة للمضادات الحيوية عن طريق نقل 50 ميكرولتر من المحلول من الصف A إلى الصف B. امزج المحلول وقم بتغيير أطراف الماصة وانقل 50 ميكرولتر من المحلول من الصف B إلى الصف C. كرر التكرار للصفوف المتبقية. بعد تخفيف الصف G ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من المحلول من هذا الصف وتخلص منه. استخدم الصف H كعنصر تحكم بدون مضادات حيوية لنمو البكتيريا. انظر الشكل 1B.
    ملاحظة: يحتوي كل بئر في الصفوف من A إلى G الآن على 50 ميكرولتر من المضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO بمعدل 2X التركيز النهائي المطلوب. يحتوي الصف H على LB + NTBC أو LB + DMSO بدون مضادات حيوية.
  7. قم بقياس OD600 من الثقافات الليلية. اغسل جميع الثقافات قبل أخذ قراءات OD600 للتخلص من البيوميلانين الموجود في وسائل الإعلام.
    1. اغسل المزارع عن طريق الطرد المركزي 1 مل من المزرعة في جهاز طرد مركزي دقيق عند 16,000 × جم لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل رطل.
  8. خفف المزرعات الليلية إلى 2.75 × 105 CFU / مل في LB.
    ملاحظه: افترض أن وحدة OD600 واحدة تعادل 1x109 CFU / ml ل P. aeruginosa. قد تختلف تحويلات OD إلى CFU / ml في البكتيريا الأخرى.
  9. أضف 50 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية المخففة إلى البئر المناسب.
    ملاحظه: يجب إضافة المزارع المزروعة في NTBC إلى الآبار المحتوية على NTBC ويجب إضافة المزارع المزروعة في DMSO إلى الآبار المحتوية على DMSO. انظر الشكل 1 ب.
    1. أضف البكتيريا إلى ثلاثة آبار لكل سلالة وتركيز المضادات الحيوية. أضف 50 ميكرولتر من LB إلى البئر الرابع ليكون بمثابة عنصر تحكم في التلوث البكتيري. انظر الشكل 1 ب.
    2. استخدم ماصة صغيرة متعددة القنوات لتلقيح الآبار. تأكد من أن أطراف الماصات بالقرب من قاع الآبار عند إضافة اللقاح لمنع تلوث الآبار المجاورة.
      ملاحظه: ستؤدي إضافة المزرعة البكتيرية إلى الآبار إلى تخفيف تركيزات المضادات الحيوية و NTBC ذات شقين.
  10. قم بتغطية الألواح المكونة من 96 بئرا بالبارافيلم واحتضانها لمدة 24 ساعة تقريبا عند 37 درجة مئوية.
  11. افحص الصفائح بحثا عن نمو البكتيريا في الآبار. MIC هو أدنى تركيز للمضادات الحيوية حيث لا يلاحظ نمو بكتيري لجميع التكرارات الثلاثة لكل سلالة.
    1. افحص اللوحة بصريا بحثا عن النمو أو اقرأ باستخدام قارئ لوحة مضبوطة علىOD 600.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي لاختبار المضادات الحيوية MIC إعداد لوحة 96 بئرا. (أ) 100 ميكرولتر من 2x من المضادات الحيوية ذات أعلى تركيز بدء في الصف A. تمتلئ الصفوف من B إلى H ب 50 ميكرولتر من LB + NTBC أو LB + DMSO بدون مضادات حيوية. (ب) يتم إجراء التخفيفات التسلسلية ذات الشقين في الصفوف من A إلى G ، مما ينتج عنه 50 ميكرولتر من المضاد الحيوي المخفف في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2- [2-نيترو-4- (ثلاثي فلوروميثيل) بنزويل] -1،3-سيكلوهكسانيديون (NTBC) سيجما ألدريتش SML0269-50 ملغ وتسمى أيضا nitisinone. قابل للذوبان في DMSO. ح2س2 سيجما ألدريتش 216763-100 مل 30 بالوزن ٪ في H2O. استقرت. الجنتاميسين جولد بيو جي 400-100 قابل للذوبان في H2O. تعقيم الفلتر. كاناميسين فيشر ساينتيك بي ت 906-5 قابل للذوبان في H2O. تعقيم الفلتر. توبرامايسين سيجما ألدريتش T4014-100 ملغ قابل للذوبان في H2O. تعقيم الفلتر.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NTBC

مقالات ذات صلة