$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. تصنيع الهلاميات الهيدروجينية الرقيقة ذات الطبقتين من مادة البولي أكريلاميد (PA) على ألواح متعددة الآبار
- قم بإذابة بيرسلفات الأمونيوم (APS) في ماء مقطر فائق النقاء لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 جم / مل. Aliquot وتخزين المحلول في 4 درجات مئوية للاستخدام قصير المدى (3 أسابيع).
ملاحظة: يمكن تحضير الحل أعلاه مسبقا لتصنيع الهيدروجيل.
- تنشيط الزجاج لأطباق 24 بئر
- احتضان ألواح سفلية زجاجية مكونة من 24 بئرا بآبار قطرها 13 مم (انظر جدول المواد) لمدة ساعة واحدة مع 500 ميكرولتر من 2 متر هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) لكل بئر في درجة حرارة الغرفة.
- اشطف الآبار 1x بالماء فائق النقاء ثم أضف 500 ميكرولتر من 2٪ (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان (انظر جدول المواد) في 95٪ إيثانول لكل بئر لمدة 5 دقائق.
- اشطف الآبار مرة أخرى بالماء وأضف 500 ميكرولتر من 0.5٪ جلوتارالديهايد إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة. اشطف الآبار 1x بالماء وجففها عند 60 درجة مئوية مع إغلاق الغطاء.
- تصنيع هيدروجيل بولي أكريلاميد
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- تحضير المحاليل المائية التي تحتوي على 3-10٪ من محلول أكريلاميد 40٪ (انظر جدول المواد) و 0.06 - 0.6٪ من محلول ثنائي الأكريلاميد 2٪ (انظر جدول المواد) لتصنيع الهلاميات المائية ذات الصلابة القابلة للضبط التي تتراوح من 0.6 كيلو باسكال إلى 70 كيلو باسكال. انظر الجدول 1.
- للحصول على هيدروجيل 0.6 كيلو باسكال ، اخلطي 3٪ أكريلاميد مع 0.045٪ ثنائي أكريلاميد. للحصول على 3 كيلو باسكال هيدروجيل، اخلطي 5٪ أكريلاميد مع 0.074٪ ثنائي أكريلاميد. للحصول على 10 كيلو باسكال هيدروجيل، اخلطي 10٪ أكريلاميد مع 0.075٪ ثنائي أكريلاميد. للحصول على 20 كيلو باسكال هيدروجيل، اخلطي 8٪ من مادة الأكريلاميد مع 0.195٪ ثنائي الأكريلاميد. للحصول على 70 كيلو باسكال هيدروجيل، اخلطي 10٪ أكريلاميد مع 0.45٪ ثنائي أكريلاميد. < / >
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول تحقيق صلابة هيدروجيل PA المرغوبة في مكان آخر.
- قم بإعداد محلولين مائيين لكل صلابة هيدروجيل مرغوبة. قم بإعداد المحلول 1 ليكون خاليا من الخرز والمحلول 2 ليحتوي على حبات فلورية دقيقة بقطر 0.03٪ 0.1 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- محاليل Degas 1 و 2 بالفراغ لمدة 15 دقيقة للتخلص من الأكسجين المعروف بتثبيط بلمرة المحاليل.
- أضف 0.6٪ من محلول APS للمخزون 10 جم / مل و 0.43٪ رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) إلى الحل 1 لتمكين بدء البلمرة. تصرف بسرعة.
- أضف 3.6 ميكرولتر من المحلول 1 إلى وسط كل بئر من الطبق المكون من 24 بئرا (انظر الخطوة 1.2 لتحضيره).
- قم بتغطية الآبار على الفور بأغطية دائرية غير معالجة مقاس 12 مم واترك المحلول 1 لمدة 20 دقيقة حتى يتبلمر بالكامل.
- اضغط برفق على إبرة حقنة على سطح لإنشاء خطاف صغير عند طرفه لتسهيل إزالة الغطاء. ارفع الغطاء باستخدام إبرة المحقنة.
- أضف 0.6٪ من محلول APS للمخزون 10 جم / مل و 0.43٪ TEMED إلى الحل 2. ضع 2.4 ميكرولتر من الخليط فوق الطبقة الأولى في كل بئر من الطبق المكون من 24 بئرا.
- قم بتغطية الحل 2 بأغطية زجاجية دائرية مقاس 12 مم ، واضغط برفق لأسفل باستخدام زوج من الملقط لضمان أن سمك الطبقة الثانية ضئيل. دع المحلول 2 يتبلمر لمدة 20 دقيقة.
- أضف 500 ميكرولتر من 50 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) درجة الحموضة 7.5 لكل بئر ثم قم بإزالة الغطاء الزجاجي بإبرة المحقنة والملقط.
- التعقيم وطلاء الكولاجين وتوازن الهلاميات المائية بولي أكريلاميد
- الأشعة فوق البنفسجية - تعريض الهلاميات المائية لمدة 1 ساعة في غطاء مزرعة الأنسجة للسماح بالتعقيم.
- تحضير خليط من 0.5٪ وزن / حجم سلفوسوكسينيميديل 6- (4′-azido-2′-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH ، انظر جدول المواد) في 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 50 ملي مولار هيبس الرقم الهيدروجيني = 7.5.
- أضف 200 ميكرولتر من هذا المحلول إلى السطح العلوي للهلاميات المائية. تعمل بسرعة ، وتعريضها للأشعة فوق البنفسجية (302 نانومتر) لمدة 10 دقائق لتنشيطها.
- اغسل الهلاميات المائية مرتين ب 1 مل من 50 ملي هيبس الرقم الهيدروجيني = 7.5. كرر إذا لزم الأمر للتأكد من إزالة أي رابط متشابك زائد.
- قم بتغطية البروتين للهلاميات المائية ب 200 ميكرولتر من 0.25 مجم / مل من ذيل الفئران الكولاجين الأول (انظر جدول المواد) في 50 ملي مولار من HEPES. احتضن الهلاميات المائية ، مع محلول الكولاجين في الأعلى ، طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: لمنع الجفاف / التبخر ، ضع الألواح متعددة الآبار في احتواء ثانوي وأضف مناديل التنظيف المختبرية المنقوعة في الماء في المحيط الداخلي للاحتواء.
- استخدم مجهر متألق أو مجهر متحد البؤر بهدف 40X لقياس سمك الهلاميات المائية. افعل ذلك عن طريق تحديد مواضع z للأسفل (حيث يوجد السطح الزجاجي) والمستوى العلوي للهيدروجيل (حيث تكون شدة حبات الفلورسنت قصوى). ثم اطرح المواضع z لتحديد الارتفاع.
ملاحظة: استخدمنا مجهر epifluorising مقلوب وهدف 40X بفتحة عددية 0.65 لقياس سمك الهلاميات المائية. يمكن أيضا إجراء قياسات الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) في هذه المرحلة لتأكيد الصلابة الدقيقة للهلاميات المائية (انظر الشكل 2).
- قبل زرع الخلايا ذات الأهمية على الهلاميات المائية ، أضف 1 مل من الوسائط على الهلاميات المائية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة لضمان التوازن.
ملاحظة: أضفنا وسائط MCDB-131 الكاملة لأن هذه هي الوسائط التي تم فيها زراعة الخلايا المضيفة النموذجية (HMEC-1) (انظر الخطوة 2.1 للحصول على التفاصيل).
فئة
2. زراعة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة البشرية والبذر على الهلاميات المائية
- زراعة خلايا HMEC-1 (بطانة الإنسان والأوعية الدموية الدقيقة) في وسائط MCDB-131 الكاملة التي تحتوي على وسائط MCDB-131 مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و 10 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة ، و 1 ميكروغرام / مل من الهيدروكورتيزون ، و 2 ملي مولار من L-glutamine (انظر جدول المواد).
- قم بتقسيم الثقافات المتقاربة 1: 6 كل 3-4 أيام واحتفظ بالخلايا حتى مرور 40.
- قبل يوم واحد من التجربة ، افصل الخلايا عن وعاء الاستزراع الخاص بها باستخدام 0.25٪ تربسين / EDTA. أولا ، اغسل الخلايا وأوعاءها المزروعة 1x بمحلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) ، ثم أضف الكمية المناسبة من 0.25٪ تريبسين / EDTA (2 مل لكل طبق 100 مم أو قارورة 75 سم ، 1 مل لكل طبق 60 مم أو قارورة 25 سم) ، احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 - 10 دقائق للسماح بانفصال الخلايا عن ركيزتها.
- قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة الحجم المطلوب من الوسائط الكاملة MCDB-131 ، وقم بتقطيع العينات برفق لتفكيك كتل الخلايا ، ثم ضع المحلول في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل.
قم - بتدوير محلول الخلايا برفق للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي ثم أخرج 20 ميكرولتر من المحلول واملأ الغرفتين برفق شديد أسفل غطاء مقياس كثافة الدم الزجاجي.
- بيليه لأسفل محلول الخلايا الموجودة في أنبوب الطرد المركزي المخروطي باستخدام الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم.
- خلال فترة الانتظار البالغة 10 دقائق ، عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. استخدم مجهرا ، وركز على خطوط الشبكة لمقياس كثافة الدم بهدف 10X ، ثم استخدم عداد الإحصاء اليدوي لحساب عدد الخلايا في مربع واحد 1 مم × 1 مم.
- انقل مقياس كثافة الدم إلى مربع آخر 1 مم × 1 مم ، واحسب الخلايا هناك ثم كرر العملية مرتين أخريين. احسب متوسط القياسات الأربعة ثم اضرب المتوسط في 104. القيمة النهائية هي عدد الخلايا القابلة للحياة / مل في معلق الخلية الذي يتم طرده بالطرد المركزي.
- قم بإزالة السائل من أنبوب الطرد المركزي المخروطي مع التأكد من عدم تعطل حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في الوسائط الكاملة MCDB-131 بتركيز 4 × 105 خلايا / مل.
- قم بزرع الخلايا المعلقة على الهلاميات المائية عن طريق إزالة الوسائط التي تم بها تحضين الهلاميات المائية أولا ثم إضافة 1 مل من تعليق الخلية على كل هيدروجيل.
< p class = "jove_title" >
3. إصابة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة البشرية بالليستريا monocytogenes (Lm)
- التحضير المسبق
ملاحظة: قم بإعداد الحلول التالية مسبقا.
- مخزونات الستربتومايسين والكلورامفينيكول والجنتاميسين
- تحضير 50 مجم / مل من محاليل مخزون الستربتومايسين بوزن 0.5 جم من كبريتات الستربتومايسين وإذابتها تماما في 10 مل من الماء عالي النقاء.
- تحضير 7.5 ملغم/مل من محاليل مخزون الكلورامفينيكول بوزن 75 ملغ من الكلورامفينيكول وإذابته تماما إلى 10 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
- قم بإعداد 20 مجم / مل من محاليل مخزون الجنتاميسين بوزن 0.2 جم من كبريتات الجنتاميسين وإذابتها تماما في 10 مل من الماء عالي النقاء.
- قم بتصفية جميع محاليل المخزون بفلتر حقنة 0.2 ميكرومتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد (1-2 شهر).
- وسائط تسريب القلب في الدماغ (BHI) وألواح الأجار
- حدد موقع قارورتين سعة 1 لتر وأضف قضيب تقليب مغناطيسي داخل كل قارورة.
- بالنسبة لوسائط BHI ، أضف 37 جم من مسحوق BHI في قارورة واحدة وأضف الماء عالي النقاء حتى 1 لتر ، امزج المحلول بقوة عن طريق وضع القارورة على لوح تقليب مغناطيسي حتى يذوب المسحوق.
- بالنسبة لألواح أجار BHI ، أضف 37 جم من مسحوق BHI و 15 جم من الأجار المحبب (انظر جدول المواد) في القارورة الثانية وأضف الماء عالي النقاء حتى 1 لتر. امزج المحلول بقوة عن طريق وضع القارورة على لوح تحريك مغناطيسي حتى يذوب المسحوق.
قم - بلف أغطية القوارير ليس بإحكام شديد وقم بتعقيم المحاليل باستخدام إعداد السائل أو وفقا لمواصفات الأوتوكلاف.
- قم بإزالة المحلول من الأوتوكلاف ، ثم قم بتبريد محلول agar-BHI إلى 55 درجة مئوية. إذا تم الحفاظ على وسائط BHI في قارورة سعة 1 لتر معقمة ، فيمكن استخدامها لمدة تصل إلى شهر.
- لتحضير ألواح أجار BHI البكتيرية ، أضف أولا المضادات الحيوية ، إذا كان ذلك مناسبا ، إلى القارورة التي تحتوي على BHI و agar (اعتمادا على السلالات البكتيرية المراد زراعتها). ضع القارورة لفترة وجيزة على لوح تقليب مغناطيسي للسماح بالخلط السريع. < / >
ملاحظة: المضادات الحيوية المستخدمة هنا خاصة بسلالات Lm المستخدمة ، ولكن يمكن استخدام أي مضادات حيوية ضرورية في ألواح BHI-agar. أضفنا الستربتومايسين إلى تركيز 200 ميكروغرام / مل وكلورامفينيكول بتركيز 7.5 ميكروغرام / مل لأن سلالات 10403S Lm مقاومة للستربتومايسين. وقد اقترن هذه السلالات مع بلازميد يحتوي على إطار القراءة المفتوح للكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز ، ومن هنا جاءت مقاومة الكلورامفينيكول.
- يسكب المزيج في أطباق زراعة بكتيريا البوليسترين مقاس 10 سم (حوالي 20 مل لكل طبق). للتخلص من الفقاعات ، قم بإشعال السطح العلوي للألواح لفترة وجيزة. تبرد الأطباق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- في اليوم التالي ، أغلق الأطباق الجافة واحفظها على حرارة 4 درجات مئوية.
- إصابة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة البشرية ب L. monocytogenes
- قبل ثلاثة أيام من الإصابة ، قم بإخراج سلالة Lm لاستخدامها من مخزون الجلسرين (المخزن عند -80 درجة مئوية) على صفيحة BHI-agar التي تحتوي على 7.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول و 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، إذا كان ذلك مناسب><ا.
ملاحظة: يمكن أن تكون السلالة المراد إخراجها من النوع البري أو المتحولة ، تعبر بشكل أساسي عن التألق (للتلطيخ المناعي JAT1045 تم استخدامه) أو التعبير عن التألق تحت محفز ActA (لقياس التدفق الخلوي أو الفحص المجهري لقوة الجر تم استخدام JAT983 أو JAT985).
- احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية حتى تتشكل مستعمرات منفصلة (1-2 يوم).
- في اليوم السابق للإصابة ، قم بزراعة السلالة المرغوبة بين عشية وضحاها ، ورجها عند 150 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية في وسائط BHI مع 7.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول (إذا كان ذلك مناسبا).
- ضع 5 مل من وسائط BHI في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل ، وأضف 7.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول (إذا كان ذلك مناسبا) ، ثم قم بتلقيح مستعمرة واحدة من صفيحة أجار باستخدام طرف معقم 10 ميكرولتر.
- في اليوم التالي ، قبل الإصابة مباشرة ، قم بقياس الكثافة البصرية لمحلول البكتيريا عند 600 نانومتر (OD600) عن طريق تخفيف العينة 1: 5 ؛ استخدم كوفيت يحتوي على BHI وحده ليكون بمثابة فراغ.
- قم بتخفيف المزرعة الليلية إلى OD600 من 0.1 واحتضانها ، مع رجها لمدة ساعتين عند 30 درجة مئوية ، في وسائط BHI مع 7.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول (إذا كان ذلك مناسبا) للسماح للبكتيريا بالوصول إلى نمو طور اللوغاريتم.
- قم بقياس OD600 للمحلول البكتيري ، والذي من المتوقع أن يكون حوالي 0.2-0.3. إذا كان OD600 أعلى ، فقم بتخفيفه إلى 0.2 - 0.3 باستخدام BHI وحده.
- خذ 1 مل من المحلول البكتيري في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قم بتدويرها لمدة 4 دقائق عند 2,000 × جم باستخدام الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل من PBS من فئة زراعة الأنسجة ، في غطاء زراعة الأنسجة. اغسل البكتيريا مرتين أخريين عن طريق تدويرها لمدة 4 دقائق عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق البكتيريا في 1 مل من PBS.
- تحضير مزيج العدوى عن طريق خلط 10 أو 50 ميكرولتر من البكتيريا المعلقة في PBS مع 1 مل من الوسائط الكاملة MCDB-131 لتعدد العدوى (MOI; أي عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة) من حوالي 50 بكتيريا لكل خلية مضيفة أو 10 بكتيريا لكل خلية مضيفة.
- قم بإزالة الوسائط من آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، مع الحرص على عدم تعطيل الهلاميات المائية أو الخلايا. اغسل الخلايا 1x باستخدام 1 مل من الوسائط الكاملة MCDB-131 ثم أضف 1 مل من البكتيريا إلى كل بئر.
- احتفظ ببعض مزيج العدوى (100 ميكرولتر على الأقل) لتحديد سبل الإنتاج (انظر الخطوة 3.3).
- قم بتغطية الطبق بغطاءه ولف الأطباق بغلاف طعام من البولي إيثيلين لتجنب التسرب. ضع الألواح في جهاز الطرد المركزي وقم بتدوير العينات لمدة 10 دقائق عند 200 × جم لمزامنة الغزو. انقل الألواح إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- اغسل العينات 4x باستخدام وسائط MCDB-131 الكاملة وانقلها إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد 30 دقيقة إضافية، استبدل الوسائط بوسائط مكملة ب 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين.
- تحديد تعدد العدوى (MOI)
- أثناء الحضانة الأولية لمدة 30 دقيقة للخلايا المضيفة مع البكتيريا ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لمزيج العدوى لتحديد وزارة الداخلية. قم بعمل تخفيفات بمقدار 10 أضعاف عن طريق خلط 100 ميكرولتر من مزيج العدوى مع 900 ميكرولتر من 1x PBS (تخفيف 10-1). ثم امزج 100 ميكرولتر من التخفيف 10-1 مع 900 ميكرولتر من PBS (تخفيف 10-2).
- استمر حتى يتم الحصول على تخفيف 10-5.
ملاحظة: يجب خلط جميع المحاليل جيدا قبل تخفيفها، ويجب استخدام أطراف ماصة نظيفة جديدة في كل خطوة.
- بمجرد إجراء التخفيفات ، ضع 100 ميكرولتر من 10-2 - 10-5 تخفيفات في وسط ألواح BHI / أجار / كلورامفينيكول / ستربتومايسين (إذا كان ذلك مناسبا).
- اصنع موزعة من ماصة زجاجية باستخدام النار لثني الماصة لإنشاء خطاف. اغمس الماصة في 100٪ من الإيثانول للتعقيم ثم احرق الإيثانول باللهب.
- بمجرد أن يبرد الموزع ، انشر التخفيفات البكتيرية بشكل متجانس على الألواح بدءا من التخفيف 10-5 والانتقال إلى الخلطات الأكثر تركيزا. احتضان الألواح رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.
- اعتمادا على كثافة المستعمرة ، حدد عدد مستعمرات إما 10-3 و 10-4 أو 10-4 و 10-5 لوحات التخفيف. احسب سبل التنفيذ على النحو التالي:
عدد المستعمرات × عامل التخفيف ÷ الحجم الأولي المضاف = عدد وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) لكل ميكرولتر
عدد CFU لكل ميكرولتر × حجم مزيج البكتيريا لكل بئر = عدد CFU لكل بئر
عدد CFU لكل بئر × حجم الخلايا لكل بئر = عدد البكتيريا لكل خلية
ملاحظة: CFU تعني وحدات تشكيل المستعمرة.
- متوسط عمليات التنفيذ من لوحين للحصول على MOIs النهائية.
< p class = "jove_title" >
4. الفحص المجهري الكمي بفاصل زمني لتقييم صلابة المصفوفة خارج الخلية
< p class = "jove_content" > قم بإعداد الهلاميات المائية PA على صفيحة مكونة من 24 بئرا (انظر
الخطوة 1) ، وبذور خلايا HMEC-1 (انظر
الخطوة 2) ، وتنمو بين عشية وضحاها مزارع JAT983 كما هو موضح أعلاه (انظر
الخطوة 3).
- في يوم الإصابة ، قم بإعداد مزيج العدوى عن طريق خلط 10 ميكرولتر من الحبيبات البكتيرية لكل مل من الوسائط الكاملة MCDB-131. قم بإزالة الوسائط بعناية من آبار الألواح المكونة من 24 بئرا ، وأضف 1.9 مل من الوسائط الكاملة MCDB-131 و 0.1 مل من المزيج البكتيري لكل بئر. < / >
ملاحظة: يعد بيان الموارد الداخلية المنخفض المستخدم في هذا الاختبار ضروريا لتحليل أحداث الانتشار التي تبدأ من بكتيريا واحدة تغزو خلية مضيفة.
- قم بتغطية اللوحة بغطاءها وأغلقها بغلاف بلاستيكي لتجنب التسرب. ضع الألواح في جهاز الطرد المركزي وقم بتدوير العينات لمدة 10 دقائق عند 200 × جم لمزامنة الغزو.
- انقل الألواح إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضانها لمدة 5 دقائق.
- اغسل العينات 4 مرات بالوسائط وانقلها إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد 5-7 دقائق إضافية ، استبدل الوسائط بوسائط مكملة ب 20 ميكروغرام / مل من الجنتامين.
- احتضن اللوحة في الحاضنة لمدة 5 ساعات إضافية للسماح لمشجع actA بتشغيل وتشغيل تعبير إطار القراءة المفتوح mTagRFP.
- قم بإعداد وسيط مجهر حي عن طريق استكمال L-15 من Leibovitz بمصل بقري للجنين بنسبة 10٪ ، و 10 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة ، و 1 ميكروغرام / مل من الهيدروكورتيزون.
ملاحظة: يحتوي L-15 بالفعل على 2 ملي مولار من الجلوتامين ، لذلك ليس من الضروري إضافة المزيد كما في حالة وسائط MCDB-131.
- امزج 1 ميكرولتر من صبغة Hoechst 1 مجم / مل مع 1 مل من الوسائط الكاملة L-15 وأضفها إلى كل بئر لتلطيخ نوى الخلايا. ضع الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق ثم استبدل في كل بئر الوسائط الكاملة L-15 ب 1 مل من الوسائط الكاملة L-15 مع 20 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. قم بتغطية اللوحة بغطاءها وضعها في الغرفة البيئية للمجهر (انظر جدول المواد) متوازنة إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: للتصوير ، تم استخدام مجهر epifluorescence مقلوب مع كاميرا CCD (انظر جدول المواد) وهدف هواء فلوريت 20X مع 0.75 NA. تم ضبط الطاقة على 50٪ ووقت التعرض على 50 مللي ثانية. مرشحات المجهر المستخدمة في mCherry هي 470/525 نانومتر للإثارة والانبعاث على التوالي.
- قم بتصوير أوضاع متعددة كل 5 دقائق باستخدام ميزة التركيز البؤري التلقائي لمراقبة كيفية انتشار Lm عبر طبقات أحادية HMEC-1 المصنفة على هلاميات هيدروجينية مختلفة الصلابة.
ملاحظة: يتم تخزين L-15 ب HEPES ، لذلك ليس من الضروري استخدام ثاني أكسيد الكربون2 أثناء التصوير.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1. تكوين الهلاميات الهيدروجينية بولي أكريلاميد (PA) ذات صلابة متفاوتة. في هذا الجدول ، يشار إلى النسبة المئوية للمخزون 40٪ محلول أكريلاميد ونسبة محلول ثنائي الأكريلاميد 2٪ لتحقيق صلابة معينة (معامل يونغ ، E) في أعمدة مختلفة.
معامل يونغ (E ، كيلو باسكال)
مادة الأكريلاميد٪ (من 40٪ مخزون)
بيساكريلاميد٪ (من 2٪ مخزون)
0.6
3
0.045
3
5
0.075
10
10
0.075
20
8
0.195
70
10
0.45 دولار
