تحديد الفعالية المضادة للفيروسات للأدوية التجريبية من خلال فحص البلاك

الملخص

المصدر: Yadavalli, T., et al. زرع أنسجة قرنية الخنازير لدراسة فعالية مضادات الفيروسات الهربس البسيط -1. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو طريقة إجراء فحص اللويحات باستخدام فيروس تم الحصول عليه من قرنية الخنازير المصابة. تستخدم قرنية الخنازير لاختبار الفعالية المضادة للفيروسات للأدوية التجريبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. القياس الكمي للعدوى الفيروسية

ملاحظة: يجب تقييم عيارات الفيروسات من قرنيات الخنازير كل يوم لتحليل تأثير العلاج الدوائي.

1. لتحديد كمية الفيروس ، قم بزرع خلايا Vero بكثافة 5 × 10⁵ من الخلايا لكل بئر إذا كنت تستخدم صفيحة من 6 آبار كما هو الحال في هذه التجربة. افعل ذلك قبل يوم من الإصابة بالعدوى. احتضان الخلايا المطلية طوال الليل للتأكد من أنها ملتقية لقياس الفيروس.
2. Aliquot 500 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل في أنابيب متعددة للطرد المركزي الدقيق. أدخل مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية مغموسة في الأنابيب الخالية من المصل المملوءة بالوسائط. يجب غمس مسحات القطن وترطيبها لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الاستخدام.
3. دون إزعاج الوسائط الأساسية ، انقل صفيحة قرنية الخنازير المصابة إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام مسحات القطن المبللة ، قم بعمل 3 دورات في اتجاه عقارب الساعة و 3 دورات عكس اتجاه عقارب الساعة بقطر 5 مم من مركز قرنية الخنازير المصابة دون الضغط المفرط.
4. أدخل قطعة القطن مرة أخرى في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المملوء بالوسائط الخالي من المصل وقم بتدويره في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة 5 مرات. يجب قطع الطرف المعدني لمسحة القطن بحيث يتناسب تماما مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق ويمكن إغلاق الغطاء.
5. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على طرف القطن المسحوب على آلة دوامة ودوامة بسرعة عالية لمدة 1 دقيقة.
6. قم بإجراء القياس الكمي للفيروس عن طريق فحص البلاك على هذه العينات.
   ملاحظه: يجب تنفيذ خطوة القياس الكمي هذه في الأيام 2 و 4 واختياريا في 6 أيام بعد الإصابة.

< p class = "jove_title" >2. القياس الكمي للفيروس بواسطة فحص البلاك

ملاحظة: لإجراء فحص البلاك ، قم بزراعة خلايا Vero وصفيحها في صفيحة من 6 آبار وتأكد من التقاء الخلايا بنسبة 90٪ قبل بدء الفحص. استخدم قارورة متجمعة 75 سم² من هذه الخلايا. يجب تنفيذ جميع الخطوات أدناه داخل خزانة السلامة البيولوجية.

1. اغسل الطبقة الأحادية المتجانسة لخلايا Vero في القارورة ب 10 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات الطازج (PBS) بعد شفط وسط الاستزراع. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى باستخدام PBS بعد شفط المجموعة الأولى من محاليل الغسيل.
2. أضف 1 مل من 0.05٪ تريبسين إلى طبقة أحادية الخلية. احتضن القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بالعين المجردة ، تأكد من فصل الخلايا عن السطح الداخلي للقارورة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانتظر لمدة 5 دقائق أخرى قبل فحص القارورة مرة أخرى. عندما تبدو الخلايا منفصلة ، أضف 9 مل من الوسائط الكاملة إلى الطبقة الأحادية للتأكد من أن الخلايا تزيح تماما من سطح القارورة.
3. اجمع كل الخلايا من القارورة مع الوسائط بأكملها وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
4. لكل بئر من 6 ألواح الآبار المستخدمة في فحص البلاك ، استخدم 300 ميكرولتر من أنبوب الطرد المركزي. قم بتعبئة كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار ب 2 مل من الوسائط الكاملة. اترك الألواح في الحاضنة طوال الليل للسماح لها بالنمو وتشكيل طبقة أحادية متقاربة في كل بئر.
5. من أجل إجراء فحص البلاك ، يجب إجراء تخفيف تسلسلي للعينات قبل القياس الكمي للفيروس.
6. قم بإجراء تخفيف للفيروس بمقدار log101 في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة باستخدام وسائط خالية من المصل حتى يتم الوصول إلى تخفيف ^10-8. عندما يكون التخفيف ^10-3 ، انقل 1 مل من التخفيف إلى الطبقة الأحادية للخلايا المطلية بعد شفط وسط النمو على الخلايا من الصفيحة المكونة من 6 آبار ، ستكون هذه هي خطوة العدوى. احتضان اللوحة المصابة عند حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
7. قم بشفط وسائط العدوى الموجودة ، واغسلها باستخدام PBS مرتين برفق لتغطية الخلايا ، وأضف 2 مل من الوسائط المحملة بميثيل السليلوز لكل بئر إلى جميع الآبار الستة. احتضن لمدة 72 ساعة أو حتى يمكن رؤية تكوين اللويحات. يمكن التعرف على اللويحات عن طريق تكوين فجوات صغيرة بين الخلايا في الطبقة الأحادية للخلية.
8. أضف 1 مل من الميثانول ببطء إلى زاوية كل بئر ، باستخدام الحائط كطرف إرشادي. احتضان الطبق المكون من 6 آبار في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. استنشق محتويات كل بئر ببطء من اللوحة دون إزعاج أو تحريك طبقة أحادية الخلية.
9. أضف 1 مل من محلول العمل البنفسجي البلوري إلى كل بئر من 6 آبار ، مع ضمان تغطية جميع الخلايا. احتضن الطبق المكون من 6 آبار في الظلام لمدة 30 دقيقة. تخلص من محلول البنفسج البلوري عن طريق شفطه وجفف الآبار على ورقة ماصة.
10. احسب عدد اللويحات عند أعلى بئر تخفيف لتحديد إجمالي محتوى الفيروس في محلول البداية. كرر العملية مرتين لتأكيد العيار الفيروسي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 30 غرام إبر تحت الجلد. دينار بحريني 305128 زجاجة 500 مل. توماس العلمية 844027 خزانة السلامة الحيوية حاصلة على شهادة السلامة الحيوية من المستوى 2 (BSL-2). ثيرموفيشر العلمي حراسيف 2030i مسحات Calgiswab 6 "مسحات قياسية معقمة من ألجينات الكالسيوم. البروتستانتي 22029501 مكشطة الخلية - 25 سم بيولوجيكس بي 70-1180 70-1250 أنبوب الطرد المركزي كريستال بنفسجي سيجما ألدريتش سي 6158 قم بتخزين المسحوق في مكان مظلم وسيط النسر المعدل من Dulbecco - DMEM جيبكو 41966029 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام ايثانول سيجما ألدريتش E7023 مصل الأبقار الجنينية - FBS سيجما ألدريتش F2442 Aliquot في أنابيب 50 مل واحتفظ بها مجمدة حتى الاستخدام خلايا فيرو مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC [رل-1586] آلة دوامة ميثانول ميثيل السليلوز أنبوب الطرد المركزي الدقيق قرنيات الخنازير بارك التعبئة والتغليف المحدودة ، شيكاغو ، إلينوي طلب خاص حسب الطلب أغطية مقاعد البدلاء - حسب الحاجة. ثيرموفيشر العلمي إس 42400 الماصات المصلية توماس العلمية P7132 ، P7127 ، P7128 ، P7129 ، P7137 معدات سحب العينات المصلية. توماس العلمية إزبيت برو مجسم كارل زايس ستيريو ديسكفري V20 قوارير زراعة الأنسجة ، T175 سم 2. توماس العلمية تي 1275 حاضنات زراعة الأنسجة التي يمكن أن تحافظ على 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية ثيرموفيشر العلمي فورما 50145523 لوحات معالجة زراعة الأنسجة (6 آبار). توماس العلمية تي 1006 التربسين