اختبار لتحديد بدء الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات على الخلايا المصابة بالفيروس

الملخص

المصدر: Plotkin، B. J. et al.، تحديد بدء الأغشية الحيوية على الخلايا المصابة بالفيروس بواسطة البكتيريا والفطريات. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو بدء تكوين الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات على الخلايا المصابة بالفيروس بواسطة البكتيريا والفطريات. تعيق عدوى فيروس الهربس البسيط الارتباط البكتيري بالخلايا ، مما يمنع التوطين المشترك بين البكتيريا والفطريات. في المقابل ، تظهر الخلايا غير المصابة توطينا مشتركا للبكتيريا والفطرية وبدء تكوين الأغشية الحيوية.

البروتوكول

فئة

1. سلالات HSV والتعامل

معها

ملاحظة: يتم استخدام HSV-1 (KOS) المؤتلف غير المنتشر gL86 و HSV-2 (KOS) 333gJ^- مع نشاط مراسل بيتا جالاكتوزيداز للمقايس.

1. استخدم الفيروسات من دفعة واحدة وخزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية بنسبة 1: 1 من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع مصل بقري للجنين بنسبة 20٪ (FBS) والحليب الخالي من الدسم حتى الاستخدام. قبل تخزين الدفعة الفيروسية ، حدد تركيز الفيروس عن طريق اختبار o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) و 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal).
2. تحديد صلاحية الفيروس وتعدد العدوى (MOI) عن طريق تلطيخ X-Gal لكل اختبار تجريبي يتم تشغيله باستخدام مقايسة إدخال فيروس المراسل ، كما هو موضح سابقا (الشكل 1).
3. تمييع الفيروس (Opt-MEM) إلى وزارة الداخلية المطلوبة. إصلاح أحادي الطبقات (بارافورمالدهيد ؛ 0.5 مل / بئر) قبل تلطيخها. ضع عناصر التحكم في بقاء الفيروس في صفيحة ميكروتيتر منفصلة بالتوازي مع لوحات الفحص متعددة الميكروبات.

2. HeLa 299 معالجة الخلايا

1. ينمو عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في DMEM مع 4.5 جم / لتر جلوكوز ، 10٪ مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة (FBS) ، جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) و L-جلوتامين. خلايا المرور عند التقاء 80٪ مع محلول التربسين (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ، 0.53 M EDTA ؛ 0.05٪ التربسين ؛ 5 مل / قارورة).

3. C. albicans التعامل

ملاحظة: يتم تخزين C. albicans التي تم الحصول عليها من مصدر مختبري سريري عند -80 درجة مئوية في حليب Remmel الخالي من الدسم 2x متوسط.

1. استزراع المرق المجمد على سابورو سكر العنب المتوسط (37 درجة مئوية). بعد 24 ساعة استزراع فرعي المطثية البيضاء على وسط الفطريات (37 درجة مئوية ؛ 48 ساعة) للاستخدام.
2. توليد أشكال الأنبوب الجرثومي (GT) (اختيار مستعمرات تمثيلية ؛ 3 مل FBS ؛ 3 ساعات ؛ 37 درجة مئوية ؛ الامتصاص₆₀₀ (ABS₆₀₀) ، 0.3). بعد الحضانة ، اغسل GT (محلول الملح المتوازن من هانكس ، HBSS ؛ 2x ؛ 4,000 × جم). أضف GT المغسول إلى HBSS الدافئ (37 درجة مئوية؛ 0.32 ABS₆₀₀). يجب أن تكون أشكال GT 99٪ من الخلايا التي تمت ملاحظتها على النحو الذي يحدده عدد مقياس الدم.
3. اصنع معلقات مخزون الخميرة (YF) عن طريق اختيار مستعمرات الفطريات التمثيلية (HBSS ، 3 مل ؛ 0.32 ABS₆₀₀). احسب عدد أشكال YF / مل مجهريا باستخدام مقياس كثافة الدم. يجب أن تكون أشكال YF 99٪ من الخلايا التي تمت ملاحظتها على النحو المحدد بواسطة عدد مقياس الدم.
4. اصنع مخزونا فطريا عاملا (250 ميكرولتر من مخزون GT أو YF في 25 مل HBSS ؛ 37 درجة مئوية ؛ 10⁵ وحدة تشكيل مستعمرة ، (CFU / مل)

4. معالجة المثانة الذهبية

1. متجر S. aureus مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ، ATCC 25923 (-80 درجة مئوية ؛ حليب ريميل الخالي من الدسم 2x). استزراع على أغار دم الأغنام (5٪؛ 37 درجة مئوية؛ 24 ساعة). اختر مستعمرات تمثيلية وانقلها إلى أملاح مانيتول متوسطة في غضون يومين للمخزون (37 درجة مئوية ؛ 18 ساعة).
2. اصنع تعليق مخزون S. aureus (3 مل HBSS ؛ 1.32 ABS_{600 ؛}10⁸ CFU / مل)
   1. اصنع مخزون المكورات العنقودية الذهبية العاملة (100 ميكرولتر من المرق في 25 مل HBSS ؛ 10⁵ CFU / مل).

5. تعليق المبيضات و S. aureus

1. اصنع علقا مختلطا من المطثية البيضاء والمكورات العنقودية الذهبية (250 ميكرولتر من مخزون YF أو GT و 100 ميكرولتر من مخزون المكورات العنقودية الذهبية في 25 مل HBSS).

< p class = "jove_title" >6. فحص الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات

1. بذور 96 لوحة بئر مع 200 ميكرولتر من 2 × 10⁵ خلايا هيلا / مل (مستوى التقاء 85٪). الصفائح الصخرية (30 - 45 دقيقة ؛ 37 درجة مئوية) قبل الحضانة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ ؛ 18 ساعة). اغسل أحادي الطبقات (1x ؛ Opt-MEM) ثم البذور مع HSV (HSV-1 (KOS) gL86 أو HSV-2 (KOS) 33 ^gJ- في 100 ميكرولتر Opt-MEM ; () التفاهم 50 و 10). احتضان الألواح (3 ساعات ؛ 37 درجة مئوية ؛ 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}). استخدم سلالة فيروسية واحدة فقط يوميا.
2. اغسل الطبقات الأحادية المصابة (1x ؛ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام Mg ^{+ 2} و Ca ^{+ 2} ؛ 100 ميكرولتر). استبدل PBS ب HBSS دافئ مع ترك 25 ميكرولتر في كل بئر.
   1. أضف معلقات العمل YF و/أو GT و/أو العقدية العنقودية الذهبية (100 ميكرولتر؛ نسبة الهدف إلى الخلية =5:1؛ العدد = 16) كما هو موضح في الجدول 1. احتضان الألواح (ثابتة ؛ 30 دقيقة ؛ 37 درجة مئوية ؛ 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
3. بعد الحضانة ، قم باستنشاق عمود واحد في كل مرة على الفور بإعادة التعبئة ب 300 ميكرولتر PBS مع Mg ^{+ 2} و Ca ^{+ 2}. كرر هذه الخطوة مرتين ثم أضف المخزن المؤقت لتحلل مقايسة الترسيب المناعي الراديوي (RIPA ؛ مرشح معقم ؛ 200 ميكرولتر من تخفيف 1:50).
قم
4. بتحليل خلية HeLa بسرعة ثم ضع 50 ميكرولتر على أملاح المانيتول (MS) و / أو وسائط الفطريات (F) (الشكل 2). انشر المحللة باستخدام قضيب زجاجي مثني بزاوية 90 درجة. احتضان الألواح (18 ساعة عند 37 درجة مئوية). احسب يدويا عدد المستعمرات لكل لوحة. تتكون الضوابط من المكورات العنقودية الذهبية و / أو المطثية البيضاء الالتزام بخلايا HeLa غير المصابة بفيروس الهربس البسيط.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تحديد القالب العام للالتصاق الميكروبي في التفاعلات متعددة الميكروبات.GT = المبيضات البيضاء النمط الظاهري للأنبوب الجرثومي ؛ YF = C. albicans الخميرة تشكل النمط الظاهري. MSSA = المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للميثيسيلين. MS = أملاح المانيتول متوسطة ؛ F = وسط الفطريات.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. صور تلطيخ X-gal لعدوى HSV-1 المعتمدة على الجرعة في خلايا HeLa. خلايا هيلا المصابة بفيروس الهربس البسيط -1 في مختلف وزارة الداخلية و X-Gal ملطخة. (أ) خلايا HeLa في بئر 96 صفيحة بئر مع تحكم في خلايا HeLa الملطخة بالملوثة ب X-Gal ؛ 20x التكبير الأولي ؛ (ب) خلايا هيلا في بئر 96 صفيحة بئر مع خلية هيلا ملطخة ب X-Gal مصابة بفيروس الهربس البسيط -1 في تعدد...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات C.albicans BBL سابورو سكر العنب دينار بحريني 211584 فطريات أجار دوت ساينتيك 7205 أ العقوف الأوريوس مانيتول سولت أجار تروي بيولوجيكس 7143 ب أغار دم الأغنام تروي بيولوجيكس 221239 خلايا هيلا 1xDMEM (وسط النسر المعدل من Dubelcco ، مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine ، بدون بيروفات الصوديوم كورنينج 10-017 سم جنتاميسين 50 مجم / مل سيغما 1397 50 ميكروغرام / مل التركيز النهائي في DMEM الكامل التربسين EDTA (0.05٪ تريبسين ، 0.53 ميجا EDTA)محلول 1X كورنينج 25-052-CI مصل الأبقار الجنينية أتلانتا بيولوجيكس S11150 تركيز نهائي 10٪ في DMEM الكامل وسيط وكواشف أخرى ONPG الترمو: العلمية 34055 فائق النقاء إكس غال إنفيتروجين 15520-018 1x HBSS (محلول الملح المتوازن من هانكس) كورنينج 20-021-السيرة الذاتية 1XPBS دوت ساينتيك 30042-500 تحلل RIPA تقنيات الحياة 89901 مؤن 96-لوحات بئر إيفرجرين ساینتيك 222-8030-01F أنابيب الثقافة 100x13 توماس العلمية 9187L61