مقايسة التخفيف الدقيق للمرق في المختبر لفحص المركبات المضادة للفطريات

الملخص

المصدر: de-Souza-Silva ، CM ، et al. التخفيف الدقيق للمرق في المختبر: طريقة سهلة وسريعة للكشف عن المركبات الجديدة المضادة للفطريات. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر لفحص المركبات المضادة للفطريات باستخدام مقايسة التخفيف الدقيق للمرق. يتم تخفيف مركبات الاختبار بشكل متسلسل في صفيحة ميكروتيتر وتحضينها بلقاح فطري. بعد الحضانة ، يتم فحص الصفيحة بحثا عن الآبار التي لا تحتوي على نمو فطري مرئي لتقييم الإمكانات المضادة للفطريات لمركبات الاختبار والحد الأدنى من تركيزها المثبط (MIC).

البروتوكول

1. الحلول والوسائط

1. قم بإعداد 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 المحلول الملحي المتوسط المخزن بالفوسفات (PBS) ، ومرق سكر العنب Sabouraud ، و Sabouraud dextrose agar وفقا للجدول 1.

< p class = "jove_title" >2. ظروف نمو اللقاح الفطري

1. قم بتخزين جميع السلالات الفطرية كمخزون مجمد في 35٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية ، لحين الحاجة.
2. قم بتنفيذ الخطوات التالية قبل كل تجربة.
   1. لسلالات المبيضات البيضاء:
      1. قم بإذابة قارورة المرق وانقل 200 ميكرولتر إلى 10 مل من مرق سكر العنب Sabouraud في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 50 مل مع غطاء وزراعته طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع التحريك (200 دورة في الدقيقة). تذكر أن تميل الأنبوب وتترك الغطاء مفتوحا قليلا لتحسين تهوية الثقافة.
   2. بالنسبة لسلالات Cryptococcus neoformans:
      1. اكشط السطح المتجمد لقارورة المخزون. ضع الخلايا على ألواح أجار سكر العنب سابورو واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية. بعد النمو المرئي للمستعمرات المعزولة ، احتفظ بالأطباق في الثلاجة (4 درجات مئوية) محكمة الغلق بغشاء البارافين لمدة تصل إلى 15 يوما.
      2. اجمع مستعمرة معزولة متوسطة الحجم من اللوحة باستخدام عود أسنان معقم أو حلقة تلقيح معقمة وتلقيح 10 مل من مرق سكر العنب سابورو في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. احتضان لمدة 24 ساعة تقريبا عند 30 درجة مئوية تحت التحريض (200 دورة في الدقيقة).
      3. لا تتجاوز فترة الحضانة لمدة 24 ساعة. تذكر أن تميل الأنبوب وتترك الغطاء مفتوحا قليلا لتحسين التهوية. من الجيد دائما توحيد مرحلة نمو الخلايا قبل كل اختبار ، لأن هذا عامل مهم يؤثر على مقاومة مضادات الميكروبات.
         ملاحظه: تمت زراعة كلا الفطريين عند 30 درجة مئوية للتكاثر السريع في تجاربنا ، ولكن يمكن تغيير درجة الحرارة لتعكس أهداف الدراسة ، على سبيل المثال العلاج السريري (37 درجة مئوية). الأهم من ذلك ، يجب تحديد وقت الحضانة الأولي هذا مسبقا لكل عزلة فطرية والحفاظ عليها طوال جميع الاختبارات لضمان قابلية التكاثر.
3. بعد نمو الفطريات ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي للأنابيب المخروطية عند 1,200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأضف 10 مل من PBS.
4. أعد تعليق الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 1,200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. كرر غسل PBS والطرد المركزي مرتين أخريين. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا في 5 مل (وفقا لحجم الحبيبات) من وسط 2X RPMI-1640.
6. قم بإعداد 1 مل من تخفيف 1: 100 أو 1: 1،000 في أنبوب طرد مركزي دقيق (اعتمادا على تعكر تعليق الخلية).
7. اقتبس 10 ميكرولتر من هذا التخفيف ، ضعه في غرفة مقياس الدم واحسب العدد الإجمالي للخلايا في أرباع الزوايا الأربعة تحت المجهر. احسب التركيز بالصيغة: (إجمالي عدد الخلية / 4) × عامل التخفيف × 10⁴ (ثابت تخفيف الغرفة).
   1. ضع في اعتبارك قابلية للبقاء بنسبة 100٪ إذا كانت معدلات الجدوى وظروف النمو مرتبطة بشكل منهجي بالعزلة قيد الدراسة.
      ملاحظه: يمكن إجراء التوحيد القياسي ومراقبة الجودة لأعداد الجدوى عن طريق الطلاء الخلفي وفقا لطريقة اللجنة الأوروبية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (EUCAST) المضادة للفطريات (MIC) للخمائر.
   2. إذا لم يتم تحديد ارتباط النمو / الجدوى للعزلة قيد الدراسة ، فقم بقياس صلاحية الفطريات عن طريق عد الخلايا الحية في مقياس كثافة الدم بمساعدة الأصباغ التي تلون الخلايا الميتة بشكل انتقائي ، مثل الفلوكسين B11 أو التريبان الأزرق أو جانوس جرين. استخدم الخلايا الفطرية لهذا البروتوكول فقط إذا كانت صلاحية السكان في هذه المرحلة 90٪ أو أعلى.
      ملاحظة: قد لا تعمل الأصباغ الميتة / الحية بشكل جيد مع الفطريات المختارة. يرجى اختبارها قبل الاستخدام. على سبيل المثال ، لا تعمل صبغة التريبان الزرقاء بشكل جيد مع C. neoformans.
8. بعد ذلك ، قم بإعداد معلقات الخلية في وسط 2X RPMI-1640 (لقاح معدل 2X في وسط RPMI-1640). بالنسبة للألواح المكونة من 96 بئرا ، ضع في اعتبارك حجم 5 مل لكل لوحة.
   1. بالنسبة لجميع سلالات المطثية البيضاء ، قم بإعداد معلق خلية مخزون 4 × 10³ خلايا / مل. هذا التركيز هو 2X من تركيز الخلية النهائي في كل بئر (2 × 10³ خلايا / مل).
   2. بالنسبة إلى C. neoformans سلالات ، قم بإعداد ثقافة مخزون من الخلايا 2 × 10⁴ خلايا / مل. هذا التركيز هو ضعف تركيز الخلية النهائي في كل بئر (1 × 10⁴ خلايا / مل).
   3. بالنسبة للفطريات الأخرى ، اختبر مضاد للفطريات معروف والذي سيكون التركيز مثاليا للدراسة المعينة فيما يتعلق بوقت الحضانة. ضع في اعتبارك وقت التمثيل الغذائي والازدواجية للفطريات.

3. الببتيدات (عامل غير معروف)

1. قم بتخزين الببتيدات المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية ، وقم بإذابتها في ماء منزوع الأيونات قبل كل تجربة. يعتمد الحد الأقصى لوقت التخزين بمجرد إذابته في الماء على طبيعة كل ببتيد.
2. قم بإعداد حصص من ضعف أعلى تركيز نهائي تم اختباره في الفحص (2X). من الناحية المثالية ، قم بإعداد عدد صغير من الحصص التي تحتوي على كمية كافية من الببتيد لمرة واحدة لتجنب دورات التجميد والذوبان.
   ملاحظه: يجب أن يعتمد اختيار التركيز على الأدبيات وخصائص الببتيد. يوصى ببدء التخفيفات التسلسلية بحوالي 100 ميكرومتر من الببتيد ، ثم تقليل أو زيادة نطاق التركيز هذا اعتمادا على النتائج التي تم الحصول عليها.

< p class = "jove_title" >4. مضادات الفطريات المرجعية (الضوابط الإيجابية)

1. بالنسبة لأولئك المخففين في الماء: قم بإعداد محلول 2X بأعلى تركيز للتحليل (انظر القسم 5: الفحص المضاد للفطريات لخطوات التخفيف).
   1. بالنسبة للمطثية البيضاء سلالات ، قم بإعداد محلول 128 ميكروغرام / مل من الفلوكونازول أو 128 ميكروغرام / مل من الكاسبوفونجين. سيكون تركيز اللوحة لكليهما 64 ميكروغرام / مل.
   2. بالنسبة للسلالات C. neoformans ، قم بإعداد محلول 32 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B (محلول قابل للذوبان في الماء). سيكون تركيز اللوحة 16 ميكروغرام / مل
      ملاحظة: عادة ما يتم تخفيف الأمفوتريسين B في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، لأن هذا المضاد للفطريات ضعيف الذوبان في الماء. ومع ذلك ، هناك مستحضرات أمفوتريسين B القابلة للذوبان في الماء متاحة تجاريا.
2. بالنسبة لمضادات الفطريات المخففة في مذيب عضوي: قم بإعداد محلول مخزون 100X في DMSO ، ثم قم بتخفيفه إلى 10X في الماء للاستخدام.
   ملاحظه: وبالتالي ، في البئر ، لن يتجاوز التركيز النهائي ل DMSO 1٪. بئر حيث ينمو الفطر في وسط يحتوي على 1٪ DMSO كتحكم مطلوب نظرا لأن بعض الفطريات لا تتحمل جيدا هذا التركيز من المذيب. تذكر أن DMSO حساس للضوء ، لذا قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم أو ضعها في غرفة مظلمة طوال فترة الحضانة.

فئة

5. فحص مضاد للفطريات

ملاحظة: يتم إجراء الفحوصات المضادة للفطريات في المختبر بناء على اختبار قابلية التخفيف الدقيق للمرق من إرشادات معهد المعايير السريرية والمختبرية (CLSI) M27-A3 مع بعض التعديلات.

1. قم بإعداد تخفيف تسلسلي مزدوج لكل ببتيد وتحكم في مضاد الفطريات في ألواح البوليسترين الدقيقة المكونة من 96 بئرا إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر.
   1. باستخدام ماصة ، أضف 100 ميكرولتر من مضاد الفطريات / الببتيد بتركيز 2X لأعلى تركيز نهائي مطلوب في الأعمدة 1-3 ، في الصف A.
   2. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 50 ميكرولتر من الماء المعقم إلى الآبار الأخرى، في الصفوف من B إلى H.
   3. قم بإزالة 50 ميكرولتر من الآبار ذات التركيز الأعلى (الصف أ) ، ونقلها إلى البئر التالي من التركيز التالي (الصف ب) وتجانس.
   4. كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى البئر بأقل تركيز وتخلص من 50 ميكرولتر من هذا البئر (الصف H). اترك العمودين 11 و 12 (الصفوف A و B و C) مع الماء فقط إما للتحكم الفارغ أو التحكم السلبي / النمو.
   5. أضف 50 ميكرولتر من اللقاح المعدل 2X في وسط RPMI-1640 إلى كل بئر (الأعمدة 1-3 بالإضافة إلى العمود 11 (سلبي / التحكم في النمو)) ؛ سيكون التركيز النهائي ل C. albicans 2 × 10³ خلايا / مل ، والتركيز النهائي لسلالات C. neoformans سيكون 10⁴ خلايا / مل.
   6. قم بإعداد أدوات تحكم فارغة (50 ميكرولتر ماء + 50 ميكرولتر 2X RPMI-1640 وسط بدون خلايا) والتحكم السلبي / في النمو (50 ميكرولتر ماء + 50 ميكرولتر لقاح معدل 2X RPMI-1640 وسط بدون مضاد للفطريات) ، وقم بتحميله في لوحة البئر كما هو موضح أعلاه.
2. كرر الإجراء لكل مركب سيتم اختباره والتحكم المضاد للفطريات المختار (الأعمدة 4-10).
   ملاحظه: يمكن إجراء التخفيفات التسلسلية عموديا مثل التجربة أدناه ، أو أفقيا في اللوحة (على سبيل المثال ، إذا كان عدد تخفيفات المركب / المستخلص المحدد الذي يحتاج إلى اختبار هو ثمانية أو أكثر).
   1. إذا كانت المركبات أو الأدوية المرجعية أو أي من مكوناتها حساسة للضوء ، فقم بإجراء الاختبار في ضوء منخفض ، أو قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم ، أو ضعها في غرفة مظلمة أثناء الحضانة.
3. ضع في اعتبارك التوصيات الاختيارية التالية.
   1. أغلق اللوحة بلوحة غطاء شفافة تسمح بتبادل الغاز ، حيث يساعد ذلك في تقليل التبخر.
   2. ضع الطبق في غرفة رطبة ؛ سيساعد أيضا في تقليل التبخر.
4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة لجميع سلالات C. albicans ، ولمدة 48 ساعة مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة ل C. neoformans. يضمن الحجم النهائي المنخفض (100 ميكرولتر) عدم حدوث أي تداعيات.
   ملاحظه: لم يلاحظ فرق كبير بين قراءات MIC عند 24 ساعة و 48 ساعة ل C. ألبكانس سلالات. ومع ذلك ، فإن القراءات عند 48 ساعة أسهل في التصور.
5. راقب جميع الآبار ، بمساعدة مجهر بصري مقلوب ، قبل فترة الحضانة وبعدها للتحقق من التغييرات في التشكل وكذلك للتحقق من علامات التلوث.
   ملاحظه: يمكن إجراء القراءات بصريا وتصويرها في نهاية التجربة. قبل كل قراءة ، قم بتجانس اللوحة قليلا. يمكن أيضا إجراء القراءات عن طريق قياس OD عند 600 نانومتر ، إذا لم يتم ملاحظة كتل الخلايا أو الخيوط.
6. قم بإجراء التجارب ثلاث مرات على الأقل في تواريخ منفصلة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. إعداد الوسائط والكواشف.

متوسط اعداد 2X معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط - 500 مل 10.4 جم RPMI-1640 (مكمل ب L-glutamine و phenol red ؛ بدون بيكربونات 330 ملي مولار 3- (N-مورفولينو) حمض البروبان السلفونيك (MOPS) اضبط على درجة الحموضة 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم التعقيم بالترشيح (مرشح 0.22 ميكرومتر) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 137 ملي كلوريد الصوديوم 2.7 ملي كلوريد الرأس 10 ملي أمبيري₂HPO₄ 2 ملي كيلو هيه₂نقطة₄ الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. مرق سكر العنب سابورو 15 جم من المسحوق في 500 مل من الماء المقطر. اضبط على درجة الحموضة 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. Sabouraud Dextrose Agar 32.5 جم من المسحوق في 500 مل من الماء المقطر. اضبط على درجة الحموضة 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

المواد