اختبار استخدام ATP لتحديد بقاء البكتيريا تحت العلاج بالمضادات الحيوية

الملخص

المصدر: وانغ, ليانغ تشون, وآخرون. الفحص الكمي لقابلية المضادات الحيوية لمجاميع النيسرية البنية باستخدام المقايسات التجارية لاستخدام ATP والتلوين الحي / الميت. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو مقايسة قياس ATP البسيطة باستخدام كاشف توهج لوسيفيراز. يستخدم هذا الاختبار لتحديد بقاء النيسرية البنية على قيد الحياة بعد العلاج بالسيفترياكسون.

البروتوكول

1. القياس الكمي للجدوى لتجميعات GC

1. اجمع GC باستخدام قضيب معقم. مسحة GC من اللوحة وإعادة تعليق GC في مرق مسخن مسبقا (GCP ، الجدول 1) مع 4.2٪ NaHCO₃ و 1٪ محاليل Kellogg. استخدم قياس الطيف الضوئي بطول موجي 650 نانومتر (OD 650 من 1 = ~ 1 × 10⁹ CFU / مل) لتحديد تركيز البكتيريا العالقة.
2. اضبط تركيز GC على ~ 1 × 10⁸ CFU / مل.
3. أضف 99 ميكرولتر من تعليق GC المعدل في آبار صفيحة 96 بئرا.
4. احتضان اللوحة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح للبكتيريا بالتجميع.
5. أضف 1 ميكرولتر من السيفترياكسون المخفف التسلسلي (1000 ، 100 ، 50 ، 25 ، 12.5 ، 6.2 ، 3.1 ، 1.5 ، 0.8 ، 0.4 ، 0.2 ميكروغرام / مل) في كل بئر. اترك بعض الآبار غير المعالجة لتكون بمثابة ضوابط.
6. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
7. قم بصوت التعليق 3 مرات في كل بئر لمدة 5 ثوان عند 144 واط و 20 كيلو هرتز.
8. أضف 100 ميكرولتر من كاشف توهج استخدام ATP المتاح تجاريا في كل بئر، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل لمدة 3 مرات، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
9. انقل 150 ميكرولتر من الخليط بعناية من كل بئر إلى بئر جديد في صفيحة سوداء سعة 96 بئرا وتجنب إدخال الفقاعات.
10. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 560 نانومتر باستخدام قارئ الألواح.
11. احسب معدل البقاء على قيد الحياة بنسبة القراءة التي تم الحصول عليها بعد المعالجة التسلسلية للسيفترياكسون إلى القراءة من الآبار غير المعالجة.

< p class = "jove_title" >2. التحليل المجهري الفلوري لأحياء / ميتة من مجاميع GC

1. اجمع GC باستخدام قضيب معقم. امسح GC من اللوحة وأعد تعليق GC في وسائط GCP الدافئة مسبقا بالإضافة إلى مكملات Kellogg بنسبة 1٪.
2. حدد عدد البكتيريا عن طريق القياس الطيفي بطول موجي 650 نانومتر واضبط تركيز GC إلى ~ 1 × 10⁷ CFU / مل.
3. أضف 198 ميكرولتر من نظام التعليق GC في غرف ذات 8 آبار ذات غطاء قاعي.
4. احتضان الغرفة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح بتكوين التجميع.
5. أضف 2 ميكرولتر من سيفترياكسون (100 ميكروغرام / مل أو تخفيفات مختلفة) في كل بئر داخل كل حالة تجميع. احتضان الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
6. أضف 0.6 ميكرولتر من خليط محلول التلوين الحي / الميت في كل بئر واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
7. احصل على صور سلسلة Z باستخدام مجهر متحد البؤر (يمكن استخدام مجهر مكافئ).
8. قم بتحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ لقياس حجم مجاميع GC ونسبة شدة التألق FIR للتلطيخ الحي إلى الميت في كل مجموعة.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: وصفة ل 1 لتر من وسائط نمو البكتيريا GCP.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل 100x Kellogg اجار الولايات المتحدة البيولوجية أ 0930 فحص BacTiter بروميجا جي 8232 سيفترياكسون TCI سي 2226 قاعدة ديفكو GC متوسطة دينار بحريني هاتف: 228950 نترات الحديديك ، غير هيدرات سيجما ألدريتش هاتف: 254223-10 جرام الجلوكوز ثيرمو فيشر العلمي BP350-1 BacLight تلطيخ حي / ميت إنفيتروجين L7012 MS11 سلالة النيسرية البنية تفضل بتقديم الدكتور هيرمان شنايدر ، معهد والتر ريد للأبحاث العسكرية سونيكاتور كونتس مكافئ ل 9110001