تحديد دور الخلايا الشبيهة بالعدلات في حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية لدواء الاختبار

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hirz، T.، et al. عزل وتحليل العدلات لتحديد دورها في حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية للعوامل العلاجية. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو فحصا يبحث في دور الخلايا الشبيهة بالعدلات في حماية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية من السمية الخلوية لعوامل العلاج الكيميائي. يتم إنشاء ثقافة مشتركة ثلاثية الأبعاد ، تتكون من سرطان الغدد الليمفاوية والخلايا الشبيهة بالعدلات ، وتعريضها للفينكريستين - دواء العلاج الكيميائي. يؤدي الاتصال المباشر بالخلايا الشبيهة بالعدلات إلى زيادة تنظيم البروتينات المضادة لموت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ، وبالتالي تعزيز بقائها في وجود فينكريستين.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. تمايز خلايا HL60 على طول مسار الخلايا الحبيبية وزراعتها المشتركة مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية RL B في نموذج ثلاثي الأبعاد

1. تمايز الخلايا النخاعية البشرية (HL60) إلى خلايا شبيهة بالعدلات
   1. اضبط رقم خلية HL60 على 3 × 10⁵ خلايا / مل ثم أضف 1 ميكرومتر من حمض الريتينويك (RA) و 1.25٪ DMSO للحث على تمايزها. قم بزرع كل 3 × 10⁵ خلايا HL60 لكل بئر في صفيحة 48 بئرا ثم احتضانها لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. في وقت لاحق ، اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق الخلايا بوسط RPMI كامل للعد باستخدام عداد بقاء الخلية.
   3. ثم قم بتخفيف تعليق الخلية في وسط RPMI كامل لضبط عدد خلية HL60 إلى 3 × 10⁵ خلايا / مل والحث مرة أخرى على تمايزها عن طريق إضافة 1 ميكرومتر من حمض الريتينويك (RA) و 1.25٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بزرع كل 3 × 10⁵ خلايا HL60 لكل بئر في صفيحة 48 بئرا واحتضانها لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. تحليل تمايز HL60 (فرق HL60)
   1. اجمع الخلايا وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق الحبيبات باستخدام وسيط معهد روزويل بارك التذكاري الكامل (RPMI) للعد باستخدام عداد بقاء الخلية.
   2. لتحليل التغيرات في تعبير علامات سطح الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. ضع كل 3 × 10⁵ خلايا HL60 غير متمايزة (من زراعة الخلايا) و 3 × 10⁵ خلاياHL60 diff في أنابيب بلاستيكية سعة 5 مل لتحليل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة 5 دقائق في RT.
   3. أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) - مصل بقري الجنين (FBS) (4٪). قم بتسمية الخلايا ب CD11b المضاد للإنسان المترافق مع AF700 أو CD38 المضاد للإنسان المترافق مع APC (5 ميكرولتر / 10⁶ خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 4 ^درجاتمئوية.
   4. يغسل ب 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) ثم جهاز الطرد المركزي عند 300 جم لمدة 5 دقائق عند RT. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
   5. قم بالتحليل على مقياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية البوابات للشكل 1A والتكوين البصري التالي: ليزر 488 نانومتر: FSC-A (488 نانومتر) ، SSC-A (488 / 10BP) ؛ ليزر 633 نانومتر: APC (660/20 BP) ، Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. لاختبار التغيرات المورفولوجية في HL60diff ، قم بتثبيت الخلايا على شرائح زجاجية للفحص المجهري.
      1. للقيام بذلك ، أعد تعليق كل 3 × 10⁴ خلايا HL60 غير متمايزة (من زراعة الخلايا) و 3 × 10⁴ HL60diff في وسط RPMI كامل 150 ميكرولتر. قم بتجميع الشرائح الزجاجية وبطاقات الترشيح وغرف العينات في جهاز الطرد المركزي للدوران الخلوي ، مما يضمن توازن جهاز الطرد المركزي.
      2. ضع كل نوع من أنواع الخلايا في غرفة العينة وجهاز الطرد المركزي الخلوي عند 1,500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في RT. قم بإزالة الشرائح وبطاقات التصفية وغرف العينات من جهاز الطرد المركزي. تفكيك بعناية ، حتى لا تتلف الخلايا الموجودة على الشريحة. تجاهل بطاقات التصفية وغرف العينات.
      قم
      3. بتلطيخ الخلايا باستخدام مجموعة تلطيخ Giemsa واحتفظ بالشرائح لمدة 1 ساعة حتى تجف. افحص الخلايا بالمجهر بتكبير 100X.
3. ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) < / > ملاحظه: تأكد من أن المواد المستخدمة في هذه التجربة باردة وأن التجربة تجري على الجليد.
   1. أعد تعليق كل 5 × 10⁴ خلايا RL ، إما بمفردها أو مختلطة معفرق HL60 بنسبة RL: HL60فرق 1:10 ، مع مصفوفة غشاء قاعدية 300 ميكرولتر باستخدام طرف ماصة 1 مل مقطوع بمقص معقم من أجل توسيع الفتحة إلى حوالي 2 إلى 3 مم. تجنب الفقاعات خلال هذه الخطوة.
   2. زرع كل 300 ميكرولتر من معلق الخلية / البئر في طبق 24 بئر. تجنب الفقاعات خلال هذه الخطوة. احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ثم أضف 1 مل وسط RPMI كامل لكل بئر واحتضانه لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بتغيير الوسيط كل يومين. أضف 10 نانومتر فينكريستين في اليوم 5.
4. تحليل FACS
   1. بعد 7 أيام من الثقافة ، قم بشفط الوسط وغسل كل منها جيدا ب 1 مل من PBS المثلج مرتين. أضف 3 مل / بئر من حمض PBS-ethylenediaminetetraacetic المثلج (EDTA) (5 ملم). افصل الجل عن قاع البئر عن طريق الكشط باستخدام قاع طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر. رج الطبق برفق على الثلج لمدة 30 دقيقة.
   2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 15 مل ورج الأنابيب برفق على الثلج لمدة 30 دقيقة أخرى. (إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بهز الخلايا لفترة أطول أو أضف المزيد من PBS-EDTA).
   قم
   3. بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT. اغسل الكريات باستخدام PBS ثم جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
   4. قم بالتعليق باستخدام PBS-FBS (4٪) وقم بتسمية الجسم المضاد CD19 المضاد للإنسان المقترن ب PE-Cy7 والجسم المضاد CD38 المضاد للإنسان المقترن ب APC (5 ميكرولتر / 10⁶ خلايا). احتضن في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 4 ^درجاتمئوية.
   5. يغسل ب 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) ثم أنابيب الطرد المركزي عند 300 جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق الخلايا باستخدام Annexin V و PI باستخدام مجموعة تجارية.
   6. قم بالتحليل على مقياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية البوابات في الشكل 2A والتكوين البصري التالي: ليزر 488 نانومتر: FSC-A (488 نانومتر) ، SSC-A (488/10BP) ، FITC (530/30 BP) ، PI (610/20 BP) ، PE-Cy7 (780/60 BP) ؛ ليزر 633 نانومتر: APC (660/20 BP). تأكد من تعويض اللون.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. المعلمات الهيكلية لخلايا HL60 المتمايزة. (أ) تمثل مخططات التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC) HL60 وخلايا HL60 المتمايزة (HL60 diff). (ب) تم تصنيف خلايافرق HL60 و HL60 بمضاد CD11b-AF700 أو مضاد CD38-APC متبوعا بتحليل قياس التدفق الخلوي. بعد البوابات على كل مجموعة من الخلايا في مخطط مبعثر FSC-A مقابل SSC-A (A)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI 1640 جيبكو إنفيتروجين هاتف: 21875-034 مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو إنفيتروجين 10270-106 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (يحتوي PBS على الكالسيوم والمغنيسيوم) جيبكو إنفيتروجين 14040-091 فينكريستين EG labo مصفوفة الغشاء القاعدي BD Matrigel BD Biosciences 354234 ضعه في 4 درجات مئوية طوال الليل قبل يوم التجربة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما ألدريتش د8418 حمض الريتينويك سيجما ألدريتش R2625 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 7906 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سيجما ألدريتش E5134 ملحق طقم تلطيخ V-FLOUS روش 11 988 549 001 طقم RAL 555 طقم تلطيخ Giemsa المعدل كوزموس بيوميديك CB361550-0000 قياس التدفق الخلوي LSRII BD Biosciences جهاز الطرد المركزي الخلوي الترمو: العلمية مجهر Leica DMR-XA لايكا مايكروسيستمز عداد الجدوى الخلوي التلقائي T4 نكسلم بيوساينس