اختبار لتقييم الهيمنة المناعية في استجابات الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا

الملخص

المصدر: Choi، J. et al.، فحوصات السمية الخلوية في الجسم الحي لدراسة الهيمنة المناعية في استجابات الخلايا التائية CD8 ⁺ الخاصة بالورم. J. Vis. Exp. (2019)

يعرض الفيديو فحصا قائما على قياس التدفق الخلوي لفحص الهيمنة المناعية في الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا أو استجابات CTL. تظهر الخلايا المستهدفة الفلورية المحقونة مضان متفاوتة تتوافق مع الحلقات المناعية. يكشف جمع وفرزة ما بعد الطحال عن انخفاض في الخلايا الفلورية عالية الكثافة ، مما يؤكد الهيمنة المناعية في استجابات CTL.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تلقيح الفئران C57BL / 6 بالخلايا السرطانية التي تعبر عن T Ag

1. قم بزراعة خط خلايا الساركوما الليفية المحولة SV40 C57SV (أو خط خلايا ملتصق مماثل ب T Ag ⁺) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر D-glucose و L-glutamine (1x) واستكمالا ب 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم و 10٪ مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة (FBS) في قوارير معالجة بزراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 10٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
2. بمجرد أن تصبح الخلايا ملتقية تماما أو مفرطة التماسك قليلا ، قم بإزالة الوسط برفق والتخلص منه وشطف الطبقة الأحادية بمحلول ملحي معقم مخزنة بالفوسفات (PBS). < / > ملاحظة: يتم تحقيق الحد الأقصى للتعبير T Ag عندما تصل خلايا T Ag ⁺ إلى التقاء 100٪.
3. داخل خزانة السلامة البيولوجية ، أضف حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك الدافئ مسبقا (تريبسين-EDTA) (0.25٪) لتغطية الطبقة الأحادية في درجة حرارة الغرفة حتى يتم إزاحة الخلايا في بقع. اضغط على جوانب قارورة (قارورات) الثقافة عدة مرات لتحرير الخلايا الملتصقة المتبقية.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر وتسريع عملية التربسين ، انقل القارورة (القوارير) إلى حاضنة 37 درجة مئوية. ستتخذ الخلايا المنزوعة بسرعة شكلا دائريا تحت المجهر الضوئي. يجب أن تستمر هذه الخطوة حوالي 5 دقائق.
4. أضف 5 مل من وسط DMEM وفصل الكتل لتحضير معلق أحادي الخلية عن طريق سحب محتوى كل قارورة لأعلى ولأسفل.
5. انقل معلق الخلية من خلال مصفاة خلوية بمسام 70 ميكرومتر إلى أنبوب.
6. قم بتدوير الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا المحببة في 10 مل من PBS المعقم والبارد.
8. كرر الخطوتين 1.6 و 1.7 مرتين.
9. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بإعداد تعليق موحد يحتوي على 4 × 10⁷ خلايا / مل PBS معقم.
10. حقن 500 ميكرولتر من المعلق أعلاه داخل الصفاق (IP) في كل فأر C57BL / 6 بالغ (6-12 أسبوعا).

< ص الفئة = "jove_title" >2. أنظمة العلاج

1. نظام علاجي لفحص مساهمة خلايا nTreg في الهيمنة المناعية T_CD8
   1. قبل أربعة أيام من التحضير في الجسم الحي للفئران C57BL / 6 بخلايا C57SV (الخطوة 1.10) ، قم بحقن كل مرة واحدة ب 0.5 مجم من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل CD25 منخفض السموم الداخلية وخالي من الأزيد (mAb) (استنساخ PC-61.5.3) ، والذي يستنفد خلايا nTreg ، أو مع تحكم النمط الإسوي IgG1 للفأر (على سبيل المثال ، استنساخ KLH / G1-2-2 ، استنساخ HRPN ، أو استنساخ TNP6A7).
2. نظام العلاج لاختبار الأهمية في الجسم الحي لتفاعلات بروتينات موت الخلايا المبرمجة (PD-1-PD-L1 (2)) في تشكيل الهيمنة المناعية T_CD8
   ملاحظة: إن إشراك PD-1 بواسطة PD-L1 في كثير من الأحيان ، ولكن ليس دائما ، يتوسط في التثبيط المشترك و / أو استنفاد T_CD8 الخاص ب Ag. لذلك ، يمكن إجراء العلاج بمضاد PD-1 بالتوازي مع إعطاء mAbs المضاد ل PD-L1 و PD-L2 للكشف عن التفاعل الدقيق بين الخلايا المتورط في ظاهرة بيولوجية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير خلايا الطحال المستهدفة

1. القتل الرحيم للفئران الساذجة C57BL / 6 المتطابقة مع الجنس (6-12 أسبوعا من العمر) والتي ستكون بمثابة متبرعين بخلايا الطحال عن طريق خلع عنق الرحم.
2. ضع كل فأر بحيث يكون بطنه متجها لأعلى داخل خزانة السلامة البيولوجية. رش الجلد بنسبة 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول ، EtOH. باستخدام ملقط ومقص معقم، ارفع الجلد وقم بعمل شق صغير في خط الوسط البطني. ثم قم بقص الجلد بطريقة تشبه الصليب لفضح الصفاق.
3. باستخدام الملقط ، اسحب الصفاق بطريقة تشبه الخيمة دون انتزاع أي من الأعضاء الداخلية. اقطع الصفاق مفتوحا لكشف التجويف البريتوني وإزالة الطحال برفق.
4. ضع الطحال (الطحال) داخل مطحنة مناديل Dounce سعة 15 مل تحتوي على 5 مل من PBS المعقم. قم بالضغط اليدوي باستخدام المكبس الزجاجي للمطحنة حتى يتبدد نسيج الطحال إلى معلق خلوي أحمر متجانس.
   ملاحظة: اعتمادا على عدد المتلقية لكل مجموعة تجريبية ، قد تكون هناك حاجة إلى العديد من طحال الفئران المتبرع لإعداد الخلية المستهدفة. يمكن تجانس ما يصل إلى 3 طحال معا داخل مطحنة سعة 15 مل.
5. انقل الجانس إلى أنبوب سعة 15 مل. قم بتدوير الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا المحببة في 4 مل من محلول التحلل الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) لمدة 4 دقائق للقضاء على كريات الدم الحمراء.
   ملاحظة: هذه خطوة حساسة للوقت. سيؤدي الإفراط في تعريض خلايا الطحال للمخزن المؤقت للتحلل ACK إلى زيادة هشاشتها وجعلها عرضة لموت الخلايا غير المحدد.
7. إلى كل أنبوب ، أضف 8 مل من معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI 1640) الوسط الذي يحتوي على 10٪ FBS معطل بالحرارة ، L-alanyl-L-glutamine ، 0.1 ملي مولار الحد الأدنى من الأحماض الأمينية غير الأساسية للوسائط الأساسية (MEM) ، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، و 1 × بنسلين / ستربتومايسين ، والذي سيشار إليه فيما بعد باسم وسط RPMI الكامل (جدول المواد).
8. انقل المحتوى من خلال مسام 70 ميكرومتر من مصفاة الخلية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.
9. قم بتدوير الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
10. تخلص من المادة الطافية. قم بتعليق الخلايا المحببة في 12 مل من RPMI الكامل.
11. قسم معلق خلايا الطحال إلى 3 أجزاء متساوية (4 مل لكل منها) في 3 أنابيب منفصلة.

< p class = "jove_title" >4. طلاء خلايا الطحال المستهدفة بالببتيدات غير ذات الصلة والمتشابهة

1. قم بتسمية الأنابيب وفقا للببتيدات التي سيتم استخدامها لنبض خلايا الطحال المستهدفة. سيتم نبض خلايا الطحال الضابطة ببتيد غير ذي صلة ، وسيتم نبض كل مجموعة من خلايا الطحال المستهدفة المماثلة بببتيد اصطناعي يتوافق مع حاتمة المناعية المشتقة من T Ag (الموقع الرابع) أو حاتمة T Ag الثانوية (الموقع الأول أو الموقع الثاني / الثالث) (الجدول 1). < / > ملاحظة: يعتمد اختيار الببتيدات غير ذات الصلة على الإعداد التجريبي وسلالة الفأر المستخدمة في كل تحقيق. غالبا ما يستخدم المؤلفون gB_498-505 (حاتمة الببتيد المناعي المقيد ب H-2K^b لفيروس الهربس البسيط [HSV] -1) و / أو GP_33-41 (حاتمة الببتيد المناعي المقيد ب H-2D^b لفيروس التهاب السحايا المشيمي الليمفاوي ([LCMV]) في الفئران C57BL / 6 (الجدول 1). هذه الببتيدات هي الخيارات المثلى لأن: (أنا) مشتقة من مسببات الأمراض التي لم تتم مواجهتها من قبل في نموذج الفأر الموصوف هنا. (ii) على غرار الببتيدات المشتقة من T Ag ، يتم تقييد gB_498-505 و GP_33-41 ^{بجزيئات} H-2 b وترتبط بها. في فحوصات القتل "ثلاثية القمم" في الجسم الحي ، قد تمثل كل من القمتين اللتين تتوافقان مع الخلايا المستهدفة المتشابهة خلايا الطحال النابضة بببتيد مناعي أو دون الهيمن. يختلف اختيار كل مجموعة ببتيد وفقا لأهداف كل تجربة. انظر الشكل 1 والشكل 2 كأمثلة على هذا الاختلاف. بالنسبة لبقية هذا البروتوكول ، سيمثل الموقعان المشتقان من T Ag I و IV الببتيدات السائدة والمسيطرة على المناعة ، على التوالي.
2. نبض محتوى كل أنبوب مسمى ب 1 ميكرومتر من الببتيد المعني لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
3. استخدم مصفاة خلوية منفصلة (بمسام 70 ميكرومتر) لكل أنبوب لإزالة الكتل والحطام إذا لزم الأمر.
4. قم بتدوير الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. أعد تعليق الخلايا المحببة في 12 مل من PBS البارد المعقم وكرر الخطوة 4.4 مرة أخرى.
   ملاحظة: من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من FBS لأن FBS يمكن أن تربط الكربوكسي فلوريسين السكسينيميديل استر (CFSE) في الخطوة التالية.

5. وضع العلامات على خلايا الطحال المستهدفة باستخدام CFSE

1. أعد تعليق خلايا الطحال النبضية بالببتيد في 4 مل من PBS المعقم.
2. أضف CFSE عند 0.025 ميكرومتر و 0.25 ميكرومتر و 2 ميكرومتر في الأنابيب التي تحتوي على الببتيد غير ذي الصلة - ، والموقع الأول - ، وموقع الطحال النبضي ، على التوالي. < / > ملاحظة: لتحقيق وضع العلامات على CFSE موحد ، أمسك كل أنبوب بزاوية 45 درجة قبل إضافة CFSE إلى الجانب أعلى قليلا من تعليق الخلية متبوعا على الفور بدوامة لطيفة. سيضمن ذلك ظهور الرسوم البيانية السلسة في النهاية. الاختلافات من دفعة إلى أخرى والمعتمدة على العمر في شدة CFSE ليست شائعة. لذلك ، قد يحتاج المرء إلى تجربة جرعات CFSE التفاضلية قبل اتخاذ قرار بشأن التركيزات المثلى التي سيتم استخدامها. < / > أنذر: CFSE سامة بتركيزات أعلى من 5 ميكرومتر.
3. ضع الأنابيب داخل حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واقلبها مرة كل 5 دقائق.
4. أضف 3 مل من FBS المعطل بالحرارة إلى كل أنبوب لإيقاف تفاعل CFSE. قم بتعبئة المحتوى باستخدام PBS المعقم.
5. قم بتدوير الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. أعد تعليق الخلايا المحببة في 12 مل من PBS المعقم وكرر الخطوة 5.5.

< p class = "jove_title" >6. فحص وضع العلامات الكافية / المتساوية CFSE لمجموعات خلايا الطحال المستهدفة

1. أعد تعليق الخلايا المحببة في 3 مل من PBS.
2. دوامة الأنابيب برفق. انقل 10 ميكرولتر ، لكل منها ، من معلقات الخلايا العالية CFSE^منخفضة ، و CFSE^{المتوسطة (int)} ، و CFSE إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بمضان البوليسترين (FACS) دائري القاع سعة 5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر من PBS.
3. استجواب الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي المزود بليزر 488 نانومتر. ارسم بوابة الخلايا الليمفاوية بناء على خصائص التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) للخلايا قبل الحصول على 5000 حدث يقع داخل بوابة الخلايا الليمفاوية في قناة FL-1.
4. ضمن مجموعة CFSE ⁺ "الأم" ، ارسم بوابات رسم بياني إضافية لتحديد المجموعات السكانية^{الفرعية المنخفضة} CFSE و CFSE int و CFSE^{العالية}.
5. تأكد من أرقام الأحداث المتساوية أو شبه المتساوية داخل البوابات الثلاث. إذا لزم الأمر ، اضبط أرقام الخلايا في أنابيب "المصدر" (الخطوة 6.1) قبل خلط وحقن خلايا الطحال المستهدفة في الفئران الساذجة والجاهزة في القسم 7.

< p class = "jove_title" >7. حقن الخلايا المستهدفة المسماة CFSE في متلقين ساذجين و T-Ag

دوامة أنابيب
1. المصدر برفق. نقل معلقات الخلايا الثلاثة المسماة CFSE بنسب متساوية إلى أنبوب جديد.
2. قم بتعبئة المحتوى باستخدام PBS المعقم.
3. قم بتدوير الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. عد الخلايا باللون الأزرق بواسطة مقياس كثافة الدم لضمان بقاء الخلايا بنسبة 95٪ على الأقل.
5. اضبط مستوى الصوت من أجل حقن 1 × 10⁷ خلايا مستهدفة مختلطة / 200 ميكرولتر PBS عن طريق الوريد (IV) ، عبر الوريد الذيل ، في كل ماوس مستلم C57BL / 6.
   ملاحظة: قم بتخزين الخلايا على الجليد بين الحقن. امزج الخلايا المستهدفة برفق قبل كل حقنة. سجل الوقت الدقيق للحقن لكل فأر ، والذي سيحدد متى سيحتاج إلى القتل الرحيم. من المهم الحفاظ على مدة السمية الخلوية في الجسم الحي متسقة بين جميع في نفس التجربة.

8. الحصول على البيانات

1. بعد ساعتين أو أربع ساعات من حقن الخلايا المستهدفة المسماة CFSE ، قم بالقتل الرحيم للفئران المتلقية عن طريق خلع عنق الرحم. < / > ملاحظة: يمكن أن تختلف مدة السمية الخلوية في الجسم الحي اعتمادا على النظام التجريبي المستخدم ، والمناعة للمستضد المستهدف ، والوفرة المتوقعة من T_CD8 الخاص بمستضد الببتيد في الطحال ، ومتانة وظيفتها المحللة من بين عوامل أخرى.
2. قم بإزالة ومعالجة كل طحال على حدة كما في الخطوات 3.2-3.9.
3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في 3 مل من PBS.
   ملاحظة: توخي الحذر الشديد للتعامل مع أنسجة الطحال ومستحضرات الخلايا عند 4 درجات مئوية أو على الجليد قبل التحليلات الفلورية الخلوية. هذا لمنع استمرار السمية الخلوية خارج الجسم الحي.
4. انقل ما يقرب من 1 × 10⁷ خلايا من كل طحال معالج إلى أنبوب FACS نظيف.
5. استجواب الخلايا على الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي المزود بليزر 488 نانومتر. ارسم بوابة الخلايا الليمفاوية بناء على خصائص FSC و SSC للخلايا.
6. تحديد خلايا الطحال في CFSE ^{المتلقي} والخلايا المستهدفة المنقولة CFSE ⁺. ارسم بوابات إضافية تستوعب مجموعات الخلايا المستهدفة^{المنخفضة} CFSE و CFSE و^{CFSE العالية}.
7. الحصول على ما مجموعه 2000 حدث^منخفض CFSE في قناة FL-1.

< p class = "jove_title" >9. تحليل البيانات

1. احسب التحلل المحدد لكل مجموعة خلايا مستهدفة متشابهة باستخدام الصيغة التالية:
   ٪ سمية خلوية محددة =
   حيث x = رقم الحدث^{المنخفض CFSE int / المرتفع} في الماوس T Ag ، y = رقم^{الحدث المنخفض} CFSE في الماوس T Ag ، a = CFSE^{int / رقم الحدث المرتفع} في الماوس الساذج ، و b = رقم الحدث^{المنخفض} CFSE في الماوس الساذج.
   ملاحظه: في فحوصات السمية الخلوية "ثلاثية القمم" التي يتم فيها تقييم التحلل المحدد لأكثر من مجموعة مستهدفة متشابهة ، ليس من المناسب استخدام ترددات الخلايا المستهدفة. هذا ببساطة لأن تواتر مجموعة الخلايا المستهدفة المماثلة لا يتأثر فقط بالنسبة المئوية للعناصر الضابطة غير ذات الصلة ولكن أيضا بنسبة خلايا الطحال المستهدفة الأخرى المماثلة. لذلك ، يجب استخدام أرقام الأحداث داخل كل بوابة في الصيغة أعلاه لحساب تحلل كل مجموعة خلايا مستهدفة متشابهة بدقة (إما الخلايا العالية CFSE int أو CFSE) مقابل عناصر التحكم^{المنخفضة} CFSE.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. الببتيدات التي تم تقديمها في هذا البروتوكول. مصدر مستضد البروتين حاتمة الببتيد تعيين تسلسل تقييد MHC I SV40¹ T Ag^{كبير 2} تي إيه_{جي 206-215} الموقع الأول سين ياقل H-2D^ب SV40 كبير T Ag تي إيه_{جي 223-231} الموقع الثاني والثالث CKGVNKEYL H-2D^ب SV40 كبير T Ag تي إيه_{جي 404-411} الموقع الرابع VVYDFLKC H-2K^ب SV40 كبير T Ag تي إيه_{جي 489-497} الموقع الخامس QGINNLDNL H-2D^ب HSV-1³ بروتين سكري ب جيجابايت_498-505* جيجابايت_498-505 سيفارل H-2K^ب LCMV⁴ البروتين السكري GP_33-41 * GP_33-41 كافينفاتك H-2D^{ب 1}فيروس سيميان 40 ²مستضد ورم كبير ³فيروس الهربس البسيط النوع 1 ⁴فيروس التهاب المشيمة السحائية الليمفاوي * يستخدم كببتيد غير ذي صلة

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحليل القياس الخلوي التمثيلي للسمية الخلوية بوساطة T_CD8 ضد الحلقات المشتقة من T Ag في وجود أو عدم وجود خلايا nTreg. تم تتبع خلايا الطحال المستهدفة النبضية بببتيدات التحكم ، والموقع الأول أو الموقع الرابع ، والتي تم تصنيفها بشكل تفاضلي باستخدام CFSE ، عن طريق قياس التدفق الخلوي في طحال فأر ساذج (اللوحة اليسرى) ، وماوس T Ag-primed المحقون ب PBS (اللوحة الوسطى) ، وماوس PC6...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.25٪ تريبسين EDTA (1X) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 25200-056 ACK Lysing Buffer ثيرمو فيشر العلمي A1049201 CD25 مضاد للماوس (استنساخ PC-61.5.3) خلية بيو إكس باء0012 مضاد للفأر PD-1 (استنساخ RMP1-14) خلية بيو إكس بي 0146 CFSE ثيرمو فيشر العلمي سي 34554 DMEM (1X) ثيرمو فيشر العلمي 11965-092 مصل الأبقار الجنينية (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 تعطيل الحرارة قبل الاستخدام جلوتا ماكس (100X) ثيرمو فيشر العلمي 35050-061 هيبس (1 م) ثيرمو فيشر العلمي 15630080 تركيز نهائي 10 ملي مولار محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X) ثيرمو فيشر العلمي 11140-050 البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش P0781 المخزون 100X الفئران IgG1 (استنساخ KLH / G1-2-2) الجنوب الحيوي 0116-01 التحكم في النمط المتساوي الجرذ IgG1 (استنساخ HRPN) خلية بيو إكس ط 0088 التحكم في النمط المتساوي الفئران IgG1 (استنساخ TNP6A7) خلية بيو إكس ص.ب0290 التحكم في النمط المتساوي الجرذ IgG2a (استنساخ 2A3) خلية بيو إكس ص0089 التحكم في النمط المتساوي RPMI 1640 (1X) ثيرمو فيشر العلمي 11875-093 بيروفات الصوديوم (100 ملم) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 11360-070 التركيز النهائي 1 ملي مولار