$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
ملاحظة: البلازميد المستخدم Lifeact-mCherry هو هدية لطيفة من الدكتور غيوم مونتانياك ، معهد كوري ، باريس.
< p class = "jove_title" >
1. الخلايا والتعداء
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تزرع البلاعم RAW264.7 إلى التقاء فرعي في وسط كامل (RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) 1640 متوسط ، 10 ملي مولار HEPES ، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، 50 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول ، 2 ملي لتر جلوتامين و 10٪ FCS (مصل عجل الجنين)) في صفيحة 100 مم. يتم نقلها باستخدام البلازميدات التي تشفر البروتينات الموسومة بالفلورسنت عن طريق التثقيب الكهربائي. بشكل روتيني ، يتم نقل ما يقرب من 5 - 6 ×
10 6 خلايا مع 20 ميكروغرام أو 10 ميكروغرام من البلازميد لكل تعداء أو تعداء مشترك على التوالي. لاحظ أنه يمكن استخدام وسائل أخرى للتعداء القائمة على التثقيب الكهربائي أو الدهون كطرق بديلة.
- اكشط الخلايا باستخدام رافع الخلايا وأعد تعليقها في 10 مل من وسط المزرعة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية 300 × جم ، 5 دقائق في RT في دوار زاوية متأرجح.
- سخني 10 مل من الوسط الكامل مع 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين عند 37 درجة مئوية.
- بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من "عازلة الغسيل A" من مجموعة التثقيب الكهربائي.
- جهاز طرد مركزي تعليق الخلية 300 × جم ، 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في دوار زاوية متأرجح.
- في غضون ذلك ، قم بإعداد مزيج الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة: 120 ميكرولتر 2x Buffer B ، 20 ميكروغرام من ترميز الحمض النووي البلازميد للبروتين محل الاهتمام ، q.s.p. 240 ميكرولتر H2O.
- بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية بالكامل.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في مزيج الحمض النووي وانقلها إلى كوفيت كهربائي 4 مم.
- احتضن في RT لمدة 3 دقائق.
- التثقيب الكهربائي عند 250 فولت ، 900 ميكرو فهرنهايت.
- أعد تعليق الخلايا على الفور في وسط كامل مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مكمل بجنتاميسين وقم بوضعها في طبق 100 مم.
- احتضان الخلايا المنقولة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- في صباح اليوم التالي ، استبدل الوسط الكامل ب 10 مل من وسط الفحص المجهري الخالي من المصل (RPMI 1640 بدون أحمر الفينول ، 10 ملي هيبس ، 1 ملي بيروفات الصوديوم ، 50 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول ، 2 ملي لتر جلوتامين).
< p class = "jove_title" >
2. تبصرة خلايا الدم الحمراء
ملاحظة: كنموذج لهدف الجسيمات للبلاعم ، يتم استخدام خلايا الدم الحمراء للأغنام (SRBCs). عادة ، يتم استخدام حوالي 7 × 106 SRBCs لكل طبق قاع زجاجي 35 مم.
- اغسل كرات الدم البيضاء ب 100 ميكرولتر من 1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) / 0.1٪ BSA (زلاليم مصل الأبقار) وأجهزة الطرد المركزي (600 × جم ، 4 دقائق).
- بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق SRBCs في 100 ميكرولتر من 1x PBS / 0.1٪ BSA وأجهزة الطرد المركزي (600 × جم ، 4 دقائق).
- بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كرات الدم الخافية في 1x PBS / 0.1٪ BSA مع IgG للأرانب المضادة لكرات الدم السرطانية عند تركيز تراص فرعي. استخدم 500 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على أجسام مضادة/5 ميكرولتر من كرات الدم السرطانية.
ملاحظه: يتوافق تركيز الأجسام المضادة التراص الفرعي مع أدنى تركيز لم يحفز التراص الذي تم اكتشافه على أنه تكوين شبكة. بشكل عام ، يبلغ تركيز التراص الفرعي 8.2 ميكروغرام / مل.
- تحديد تركيز IgG المضادة لكرات الدم السرطانية المطلوبة لمعالجة كرات الدم السرطانية عن طريق اختبار التضخم. قم بتخفيف IgG المضادة لكرات الدم السرطانية (مخزون 13.1 مجم / مل) بين 1/50 - 1 / 25,600 في صفيحة دقيقة. أضف 2 × 106 SRBCs في كل بئر. احتضن اللوحة في الظلام في RT لعدة ساعات.
- احتضن في RT لمدة 30 دقيقة مع دوران بطيء.
- بعد غسلتين في 1x PBS / 0.1٪ BSA كما هو موضح أعلاه ، قم بإعادة تعليق SRBCs المعالج ب IgG (IgG-SRBCs) في وسط الفحص المجهري الخالي من المصل المسخن مسبقا (2 مل / طبق).
فئة < p = "jove_title" >
3. طلاء بولي ليسين من Coverslips
- في غضون ذلك ، قم بمعالجة أطباق القاع الزجاجي مقاس 35 مم ب 2 مل من 0.01٪ بولي إل ليسين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الأطباق مرتين ب 2 مل من 1x PBS.
فئة
4. التثبيت غير التساهمي ل SRBCs على أطباق القاع الزجاجي
- صب 2 مل من تعليق SRBCs لكل طبق سفلي زجاجي مقاس 35 مم.
- جهاز طرد مركزي مع دوار متأرجح عند 500 × جم خلال دقيقتين على أطباق قاع زجاجية مقاس 35 مم.
- قم بإزالة المادة الطافية واغسلها مرة واحدة ب 2 مل من 1x PBS / 10٪ BSA.
- احتضان الجسيمات لمدة 30 دقيقة مع 2 مل من 1x PBS / 10٪ BSA لكل طبق.
- اغسل الأطباق ثلاث مرات ب 2 مل من 1x PBS.
- استبدل 1x PBS ب 2 مل من وسط الفحص المجهري الخالي من المصل المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
< p class = "jove_title" >
5. البلعمة التي تم تصورها بواسطة TIRFM
- مجهر
ملاحظه: تم إجراء TIRFM باستخدام مجهر مجهز بهدف غمر الزيت (N 100X ، NA1.49) ، وغرفة تسخين مع ثاني أكسيد الكربون2 ، وكاميرتين فرديتين للكشف عن الفوتون EMCCD (جهاز اقتران شحنة مضاعفة الإلكترون) إلى جانب عدسة 1.5X.
- في اليوم السابق لجلسة مجهر TIRF ، قم بتشغيل غرفة التسخين عند 37 درجة مئوية للسماح بتسخين متجانس لمرحلة المجهر.
- تحديد الزاوية الحرجة
ملاحظه: يستخدم برنامج ImageJ Color Profiler لمعالجة تدفقات صور TIRF.
- ضع طبقا زجاجيا قاعيا مقاس 35 مم يحتوي على SRBC opsonized مع وسيط مجهر خال من المصل تحت المجهر.
- اكشط الخلايا وأعد تعليقها في الوسط قبل إضافتها (100-500 ميكرولتر) في الطبق.
- استخدم برنامج "Live Acquisition" للتحكم في المجهر وإجراء الإثارة باستخدام ليزر 491 نانومتر و / أو 561 نانومتر لتحديد الخلايا التي تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية.
- حدد الخلية التي تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية.
- ضعه في منتصف الحقل واحصل على 500 صورة بطول موجي واحد للإثارة ، بزوايا مختلفة تبدأ من 0 درجة إلى 5 درجات ، بزيادة قدرها 0.01 درجة (الشكل 1 أ). يتم تغيير الزوايا تلقائيا بواسطة نظام المجهر.
- حدد الزاوية الحرجة التي تسمح بانعكاس الضوء الساقط بالكامل على الواجهة الزجاجية / المتوسطة وتوليد الموجة الزائلة. باستخدام برنامج ImageJ Color Profiler ، افتح تسلسل الصورة بالنقر فوق "ملف" و "فتح" وحدد الملف.
- حدد منطقة الاهتمام (ROI) ، باستخدام الأداة المستطيلة ، في الخلية ذات التألق المنتظم (الشكل 1 ب أصفر 1).
- ارسم "ملف تعريف المحور Z" متوسط شدة التألق المقاسة في عائد الاستثمار مع دالة الزوايا على المحور x بالنقر فوق علامة التبويب "صورة" و "المداخن" في القائمة المنسدلة و "رسم ملف تعريف المحور Z" (الشكل 1B أحمر 2).
ملاحظة: الزاوية الحرجة هي الزاوية المؤدية إلى الحد الأقصى للتألق قبل انخفاض حاد في الفلورة.
- استخدم أي قيمة زاوية على المحور x أعلى من الزاوية الحرجة أثناء جلسة الفحص المجهري للحصول على إشارة TIRF كمثال 2.00 (الشكل 1C).
- الاستحواذ
- باستخدام برنامج Live Acquisition ، قم بإعداد معلمات الاستحواذ باستخدام الوحدة النمطية "محرر البروتوكول" (الشكل 2 أ).
- قم بإنشاء بروتوكول ب "حلقة" تشتمل على اكتساب "قنوات متعددة" للحصول على إشارة الفلورسنت من البروتينات ذات الأهمية في منطقة TIRF. أدخل زاوية TIRF (على سبيل المثال 2.00) ووقت التعرض (على سبيل المثال 50 مللي ثانية) وشدة الليزر (على سبيل المثال 50٪) (الشكل 2B 1).
- أدخل "حركة Z" للهدف 3 ميكرومتر فوق منطقة TIRF للحصول على اكتساب الإشارة في التألق السطحي باستخدام أداة "القنوات المتعددة". أدخل زاوية أقل من الزاوية الحرجة (على سبيل المثال 1.00) ، ووقت العرض (50 مللي ثانية) وشدة الليزر (50٪) (الشكل 2 ب ، 2 و 3).
- بعد ذلك ، أضف "حركة z" للهدف 3 ميكرومتر أدناه ، للعودة إلى منطقة TIRF (الشكل 3 ب 4). أضف "لقطة" للخلية في LED للضوء الساطع (الصمام الثنائي الباعث للضوء) (الشكل 2 ب 5).
- ابحث عن خلية ذات أهمية ذات مستوى معتدل من تعبير البروتين الموسوم بالفلورسنت الذي يبدأ البلعمة في SRBC عن طريق تمديد غشاء البلازما حول الجسيم.
- ضعه في منتصف الحقل.
- ابدأ في الحصول على 500 - 1,000 إطار. في علامة التبويب "عدد الحلقات" ، أدخل "750 إطارا" (الشكل 2B 1).
ملاحظه: يستخدم برنامج ImageJ Color Profiler لمعالجة تدفقات صور TIRF.
- افتح صور التسلسل في برنامج Image J بالنقر فوق "ملف" و "فتح" واختيار الملف.
- افصل القنوات بالنقر فوق علامة التبويب "صورة" والقائمة المنسدلة "Hyperstacks" وعلى وظيفة "Stack to hyperstack". أكمل النافذة الظاهرة: الترتيب: xyctz; القناة (ج): عدد القنوات (على سبيل المثال: "2" إذا كان لديك فلوروكروم)؛ الشرائح (z): عدد الشرائح في المحور z (على سبيل المثال: "1" إذا لم تكن هناك حركة في المحور z) ؛ الإطارات (ر): عدد الصور مقسمة حسب عدد القنوات؛ وضع العرض: تدرج الرمادي.
ملاحظه: يتم إنشاء تسلسلين منفصلين للصور ، يتوافقان مع القناتين المختلفتين.
