اختبار في المختبر لتقييم التأثير المناعي للخلايا الوحيدة على تكاثر الكريات البيض

الملخص

المصدر: Hsu، P.، et al. تقييم الخصائص المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs). J. Vis. إكسب. (2015)

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر لاستكشاف التأثير المناعي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على تكاثر الخلايا التائية المستجيبة. يتضمن الاختبار الزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الجذعية مع PBMCs لحث مجموعة الخلايا الوحيدة على الحصول على نمط ظاهري معدل للمناعة ، مما يؤدي إلى إفراز الإنترلوكين -10 (IL-10). بعد الحضانة بخلايا CD4 ⁺ T المنشطة ، تمنع الخلايا الوحيدة المستحثة بشكل فعال تكاثر الخلايا التائية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. عزل تدرج الكثافة لخلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs)

1. أضف 25 مل من الدم الكامل الهبارين إلى أنبوب سعة 50 مل بواسطة ماصة سعة 25 مل.
   1. تمييع الخلايا ب 25 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. أضف 15 مل من تدرج كثافة Ficoll-Paque في أنبوب جديد سعة 50 مل ، وأثناء إمالة الأنبوب ، أضف ببطء شديد وبعناية 25 مل من تعليق الخلية المخفف فوق تدرج الكثافة بحيث لا يكون هناك اختلاط للدم الكامل مع تدرج الكثافة ، أي عدم حدوث أي اضطراب في واجهة تدرج كثافة الدم.
قم
3. بجهاز الطرد المركزي للتعليق من الخطوة 1.2 عند 400 × جم لمدة 30 إلى 40 دقيقة في دوار دلو متأرجح يتم التحكم في درجة حرارته بدون فرامل عند 20 درجة مئوية><. ملاحظه: يجب أن تظهر ثلاث طبقات متميزة بعد الطرد المركزي: الطبقة العليا هي البلازما. الطبقة السفلية الواضحة هي تدرج كثافة Ficoll-Paque. وطبقة خلوية رقيقة ومتوسطة هي PBMCs.
4. قم بشفط الطبقة العليا والتخلص منها عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الطور البيني للخلايا أحادية النواة (مثل الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والصفائح الدموية).
5. اجمع طبقة الخلية أحادية النواة هذه بعناية باستخدام ماصة سعة 10 مل إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
6. املأ الأنبوب ب 20 مل من PBS ، واخلطه جيدا ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما بعد الطرد المركزي.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10-15 دقيقة عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما بعد الطرد المركزي.
   ملاحظه: تزيل هذه الخطوة الصفائح الدموية - غير المرغوب فيها - داخل PBMCs. يمكن تكرار هذه الخطوة لضمان الإزالة الكاملة للصفائح الدموية.
8. إذا لم يكن هناك رغبة في اختيار مجموعات محددة ، فقم بتعليق حبيبات الخلية في وسط كامل للكريات البيض (10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ L-glutamine ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في وسط RPMI-1640) للزراعة بعد إجراء تعداد الخلايا لتعليق 1 مل من الوسط لكل 10⁷ PBMCs قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

2. وضع العلامات المغناطيسية لمجموعات الكريات البيض

1. نظام التعليق PBMC للطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق وشفط الطاف تماما.
2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 80 ميكرولتر من PBS لكل 10⁷ خلايا إجمالية.
3. أضف 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المحدد (أي الخرز المغناطيسي CD14 لعزل الخلايا الوحيدة ، والخرز المغناطيسي CD4 لعزل الخلايا الليمفاوية التائية) لكل 10 7 خلايا إجمالية.
4. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 2 إلى 8 درجات مئوية في الثلاجة.
5. أضف 1-2 مل من PBS لكل 10⁷ خلايا لغسلها ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
6. شفط طافي تماما وإعادة تعليق ما يصل إلى 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من PBS.

3. الاختيار المغناطيسي للمجموعات السكانية الفرعية للكريات البيض

ملاحظة: تتوفر مجموعة متنوعة من فواصل وأعمدة الخرز المغناطيسي لعزل مجموعة معينة من الكريات البيض بواسطة علامة سطح الخلية من عدد من الشركات المصنعة. يمكن أن يكون العزل عن طريق الانتقاء الإيجابي بناء على علامة إيجابية واحدة أو بضع علامات إيجابية أو عن طريق الانتقاء السلبي بعد استنفاد السكان غير المرغوب فيهم. يتم توضيح نهج عام لإجراء الانتقاء الإيجابي باستخدام علامة واحدة (على سبيل المثال ، CD4 للخلايا الليمفاوية التائية المساعدة ، أو CD14 للخلايا الوحيدة).

1. إعداد ورئيس فاصل مغناطيسي بما في ذلك عمود الفصل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. ضع أنبوبا يحتوي على عينة من PBMCs المسماة. قم بتوفير أنبوبين للطرد المركزي سعة 15 مل لجمع كسور الخلايا ذات العلامات الإيجابية وغير المسماة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
3. عد عدد الخلايا وأعد تعليق الكريات البيض المختارة إيجابيا (أي الخلايا الليمفاوية CD4 ⁺ T أو خلايا CD14 ⁺) في وسط كامل للكريات البيض ، باستخدام 1 مل من الوسط لكل 10⁷ خلايا.

فئة

4. كربوكسي فلوريسين إستر السكسينيمديل (CFSE) تلطيخ الكريات البيض لتقييم الانتشار

ملاحظة: تم استخدام CFSE على نطاق واسع في التحقيقات المناعية ، لكل من الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر. تم تحسين بروتوكولنا للدراسة المختبرية لتفاعلات MSC / PBMC (أو الكريات البيض الأخرى). في حين أن الخطوات العامة المتبعة في إجراء CFSE في المختبر متشابهة ، فقد تكون هناك اختلافات في الجرعة المحددة وتوقيت البروتوكول. قد يكون هذا بسبب عدد من العوامل ، أي نوع الخلية المحدد المستخدم ، وأرقام الخلايا المستخدمة - والتي يمكن أن تؤثر على الأرجح على شدة إشارة الفلورسنت CFSE.

1. قم بتخفيف محلول مخزون CFSE (10 ملم) في PBS إلى تركيز العمل المطلوب البالغ 10 ميكرومتر (محلول عمل CFSE). قم بإعداد 10⁷ خلايا (أي PBMCs أو الخلايا التائية) لوضع العلامات باستخدام محلول عمل CFSE.
2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق للحصول على حبيبات خلية وشفط المادة الطافية.
3. أعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من محلول CFSE الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. لغسل CFSE الزائد، قم بتخفيف تعليق الخلية بمقدار 10x (من حيث الحجم) من وسط RPMI المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) الذي يحتوي على 10٪ FBS. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. اغسل حبيبات الخلية بهذه الطريقة مرتين أخريين.
5. أعد حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي وعد عدد الخلية. أعد تعليق 10⁷ خلايا (إما PBMCs أو الخلايا التائية) في 1 مل من الكريات البيض الطازجة الدافئة مسبقا في وسط كامل.

فئة

5. مقايسة قمع المستجيب الكريات البيض المعدلة للمناعة المختارة من الخرزة المغناطيسية ، والتي يسببها MSC على خلايا المستجيب CD4 ⁺ T المنشطة المسماة CFSE

1. البذور الخلايا الجذعية الجذعية في 250,000 خلية في 3 مل من MSC وسط كامل في ألواح 6 آبار (كثافة MSC: 25,000 خلية / سم²) لربط O / N في حاضنة 37 درجة مئوية ، مما يسمح للخلايا الجذعية بالوصول إلى 80٪ التقاء. ما لا يقل عن 3 ألواح مكونة من 6 آبار ضرورية لضمان ما يكفي من PBMCs المستزرعة بالخلايا الجذعية لاختيار السكان الفرعيين.
2. استنشق وسط وأضف PBMCs مفصولة وفقا للخطوة 1 ولكن في ألواح مكونة من 6 آبار عند 2.5 × 10⁶ خلايا / بئر (كثافة الخلية: 250.000 كريات البيض / سم²) مع 3 مل من الكريات البيض المتوسطة الكاملة. الاستزراع المشترك لمدة 48-72 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
3. مجموعة محددة من الكريات البيض المعدلة للمناعة التي يسببها MSC (أي خلايا CD14 ⁺) وفقا للأقسام 2-3.
   ملاحظه: يمكن إجراء تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي في هذه المرحلة لتقييم التغيرات في ملف تعريف تعبير السيتوكين للكريات البيض ، أي التعبير عن الإنترلوكين -10 كما تم تعديله بواسطة الخلايا الجذعية الجذعية.
4. أضف خلايا CD4 ⁺ T الخيفية المسماة CFSE التي تم إنشاؤها وفقا للأقسام 2-4 في ألواح 24 بئرا في 1 مل من الوسط الكامل للكريات البيض (كثافة الخلايا التائية: 250،000 خلية / سم²) إلى الكريات البيض التي يسببها MSC المختارة بنسب مختلفة ، أي 1:10 و 1: 5 و 1: 2 و 1: 1 (خلية إلى خلية).
5. لتحفيز خلايا CD4 ⁺ T ، أضف α-CD3 / 28 microbeads المترافقة للحصول على نسبة حبة إلى خلية تبلغ 1: 1.
6. للتحكم السلبي ، لوحة 500,000 CD4 ⁺ خلايا تائية / بئر في صفيحة 24 بئرا (كثافة الخلايا التائية: 250,000 خلية / سم²) مع 1 مل بيضاء متوسطة كاملة فقط ؛ للتحكم الإيجابي ، بالإضافة إلى طلاء نفس العدد من خلايا CD4 ⁺ T / البئر ، أضف α-CD3 / 28 microbeads المترافقة للحصول على نسبة حبة إلى خلية تبلغ 1: 1.
7. في اليوم الثالث من الزراعة المشتركة ، قم بتقييم تكاثر الخلايا التائية CD4 ⁺ المسماة CFSE (الموضوعة في أنابيب مستديرة القاع) عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي مع مرشحات الإثارة والانبعاث 488 نانومتر المناسبة للفلورسين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 71-7167-00 م كثافة كبيرة لعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) طقم تتبع الخلايا CFDA-SE النابض بالحياة (CFSE) تقنيات الحياة الطراز V12883 ملصق خلوي للكشف عن انقسام الخلايا Dynabeads بشري T-Activator CD3 / 28 تقنيات الحياة 111.32 د تنشيط الخلايا الليمفاوية التائية البشرية ، مثل الخلايا التائية CD4 + ، الخلايا التائية CD8 + ، إلخ. فاصل autoMACS™ ميلتيني بيوتيك فاصل autoMACS™ فاصل الخلايا المغناطيسي أعمدة autoMACS® ميلتيني بيوتيك 130-021-101 أعمدة الفصل الميكروبيدات CD14 ، الإنسان ميلتيني بيوتيك 130-050-201 للاختيار الإيجابي للخلايا الوحيدة البشرية CD14 + والضامة من PBMCs ميكروبيدات CD4 ، بشرية ميلتيني بيوتيك 130-045-101 للاختيار الإيجابي للخلايا الليمفاوية التائية البشرية CD4 + من PBMCs RPMI 1640 متوسط تقنيات الحياة 11875 وسط ثقافة PBMC / الكريات البيض البشري DMEM ، منخفض الجلوكوز ، البيروفات تقنيات الحياة 11885 وسط زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSC) ل-جلوتامين تقنيات الحياة هاتف: 25030-081 مكملات لوسيط MSC الكامل البنسلين / الستربتومايسين تقنيات الحياة 15070-063 مكملات PBMC/الكريات البيض ووسط MSC الكامل مصل الأبقار الجنينية (FBS) 1) Hyclone ، لثقافة MSC ، 2) تقنيات الحياة ، لجميع الخلايا الأخرى (أي PBMCs ، مجموعات كريات البيض المحددة) 1) SH30070.03 م 2) 10091-148 الكثير من الاختبار المسبق لدعم MSC في الثقافة المختبرية لوحة زراعة الخلايا 24 بئر كورنينج COR3524 لوحة الثقافة المشتركة أنبوب الطرد المركزي 50 مل كورنينج 430291 عزل PBMCs عن الدم الكامل بواسطة Ficoll-Paque PLUS أنبوب الطرد المركزي 15 مل كورنينج 430766 مجموعة من كسور الخلايا المسماة وغير المسماة أنابيب مستديرة القاع بي دي فالكون 352008 مجموعة الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي