تحقيق التدفق في المختبر لتأثير الخلايا اللحمية على تجنيد الكريات البيض

الملخص

المصدر: Munir، H. et al.، تحليل تأثيرات الخلايا اللحمية على تجنيد الكريات البيض من التدفق. J. Vis. Exp.(2015)

يوضح الفيديو طريقة للتحقيق في تأثير الخلايا اللحمية على تجنيد الكريات البيض. في نموذج غرفة تدفق اللوحة المتوازية ، تحفز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التعبير عن مستقبلات الالتصاق بواسطة الخلايا البطانية ، مما يسهل تجنيد العدلات وهجرتها. يقلل الحديث المتبادل بين الخلايا اللحمية والخلايا البطانية من تجنيد العدلات في الخلايا البطانية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. عزل وثقافة الخلايا البطانية البشرية الأولية والخلايا الجذعية الوسيطة

1. عزل واستزراع الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC):
   1. ضع الحبل السري على صينية بها مناشف ورقية ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضعها في غطاء مزرعة الأنسجة. حدد الوريد وقم بتسلية الوريد في كلا الطرفين. ضع ربطة كابل حول الطرف المقنع لتثبيته.
   2. اغسل الدم الوريدي بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام حقنة. املأ المحقنة بالهواء ومرر عبر الوريد لإزالة والتخلص من PBS المتبقي.
   3. قم بإذابة 10 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع Ia وقم بتخفيفه بنسبة 1:10 في PBS (مع كلوريد الكالسيوم والمغنيسيوم) إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل. مرر محلول الكولاجيناز في الوريد حتى تمتلئ كلا القنيات. أغلق المشابك الموجودة على القنيات من كلا الطرفين.
   4. غطي الصينية بالمناديل ورشيها بنسبة 70٪ إيثانول. ضع السلك في حاضنة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
   5. أخرج السلك من الحاضنة وشد روابط الكابلات. قم بتدليك الحبل بلطف لمدة 1 دقيقة. اغسل معلق الخلية ب 10 مل PBS واجمعه في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
   6. املأ المحقنة بالهواء ومرر عبر الوريد لإزالة أي بقايا PBS مرتين ، وجمع PBS في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل المستخدم في الخطوة 1.1.5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   7. شفط الطاف وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل خلية بطانة كاملة (EC) متوسطة. يتكون وسط EC من M199 مكمل ب 35 ميكروغرام / مل من كبريتات الجنتاميسين ، و 10 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة البشرية ، و 1 ميكروغرام / مل من الهيدروكورتيزون ، و 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B ، و 20٪ مصل عجل الجنين.
   8. أضف 4 مل من وسط EC وتعليق EC إلى قارورة 2 مقاس 25 سم. قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل يومين.
   9. تظهر ECs مورفولوجيا تشبه الحصى (الشكل 1Ai). بالنسبة لمقايسات الالتصاق ، يتم زرع ECs بشكل عام عندما تصل إلى التقاء 100٪ (انظر القسم 1.4).
2. عزل الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية من وارتون (WJMSC) عن الحبل السري البشري:
   1. اعزل MSC المشتق من الهلام (WJMSC) من الحبال السرية الطازجة أو من الحبال التي تم استخدامها بالفعل لعزل EC. قطع الحبل السري إلى قطع بطول 5 سم. قص كل قطعة طوليا للكشف عن الأوعية الدموية (شريانتان [أبيض، صلب] ووريد واحد [أصفر منتفخ]).
   2. باستخدام مقص وملقط معقم ، قم بإزالة الأوعية الدموية والتخلص منها. قطع كل الأنسجة إلى 2 - 3 مم³ قطع. باستخدام الملقط ، ضع 2-3 مم³ قطع في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
   3. قم بإذابة 100 ملغم / مل من الكولاجيناز من النوع الثاني وقم بتخفيفه 1: 100 في 10 مل PBS إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل. قم بإذابة 20,000 وحدة / مل من مخزون الهيالورونيداز وتخفيفه 1: 400 إلى تركيز نهائي قدره 50 وحدة / مل في محلول الكولاجيناز.
   4. أضف كوكتيلا إنزيميا إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على شظايا الأنسجة. احتضان شظايا الأنسجة لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية على دوار بطيء.
   5. خفف تعليق الخلية 1:5 في PBS. ضع مرشح مسام 100 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل. صب معلق الخلية على مرشح المسام 100 ميكرومتر.
      ملاحظه: سيتم الاحتفاظ بشظايا الأنسجة المتبقية على المرشح وسيتم جمع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل.
   6. تجاهل الفلتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في RT. قم بشفط الحبيبات الطافية وإعادة تعليق حبيبات WJMSC في وسط ثقافة WJMSC كامل سعة 12 مل (Dulbecco's Modified Eagle Medium ، و DMEM منخفض الجلوكوز ، ومصل ربلة الساق الجنينية 10٪ (FCS) و 100 وحدة / مل بنسلين + 100 ميكروغرام / مل من مزيج الستربتومايسين).
   7. بذر جميع الخلايا في قارورة زراعة الأنسجة مقاس 75 سم². قم بتغيير الوسط بعد 24 ساعة باستخدام 12 مل من وسط ثقافة WJMSC الكامل. استبدل الوسط كل 2-3 أيام. يجب أن تصل الخلايا إلى 70 - 80٪ التقاء في غضون أسبوعين. المرور عندما يصل WJMSC إلى 70 - 80٪ التقاء (انظر القسم 1.4).
3. توسيع MSC المشتق من نخاع العظام (BMMSC):
   1. عزل MSC المشتق من نخاع العظام البشرية (BMMSC) كما هو موضح سابقا. أضف 10 مل من الخلايا الجذعية الوسيطة الدافئة مسبقا ، وسط نمو MSC (MSCGM) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
   2. قم بإذابة قارورة p2 BMMSC عن طريق وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات.
   3. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT. شفط طافي تماما.
   4. أعد تعليق الخلايا في 1 مل MSCGM وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الرقمي مثل مقياس الخلوي.
   5. خلايا البذور في قوارير ثقافة 75 سم² بكثافة 5,000 - 6,000 خلية لكل سم² في 12 مل MSCGM. قم بتغيير الوسط بعد 24 ساعة باستخدام 12 مل MSCGM. تغذية الخلايا ب 12 مل من MSCGM كل 2-3 أيام.
   6. المرور عندما يصل BMMSC إلى التقاء 70-80٪ (انظر القسم 1.4). تظهر الخلايا مورفولوجيا الخلايا الليفية (الشكل 1Aii).
4. مفرزة EC و MSC:
   1. وسط الشفط من 25 سم² قوارير استزراع. أضف 2 مل من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك 0.02٪ (EDTA) لمدة دقيقتين تقريبا. شفط EDTA وأضف 2 مل من التربسين (2.5 مجم / مل). انظر تحت المجهر حتى تصبح الخلايا مستديرة.
   2. اضغط على القارورة لفصل الخلايا. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 8 مل وسط ثقافة (حسب نوع الخلية ؛ وسيط EC ل HUVEC و DMEM LG ل WJMSC و MSCGM ل BMMSC) إلى قارورة الثقافة ونقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
   3. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT. شفط طافي وإعادة تعليق الحبيبات كما هو موضح أدناه.
      1. لتمرير MSC ، أعد تعليق الحبيبات في وسط استزراع 3 مل. أضف 11 مل وسط مزرعة إلى ثلاث قوارير منفصلة مقاس 75 سم². أضف معلق خلية 1 مل إلى كل قارورة مزرعة (تقسيم 1: 3). قم بتمرير WJMSC و BMMSC 3 مرات (p3) قبل استخدامها في فحوصات الثقافة المشتركة.
      2. لبذر EC أو MSC في فحوصات الالتصاق - انظر القسمين 2 و 3.
5. تجميد MSC:
   1. عند المقطع 3 ، افصل MSC كما هو موضح في القسم 1.4. قم بشفط الطافي وإعادة تعليقه في 3 مل CryoSFM المثلج. ماصة 1 مل من معلق الخلية إلى 1.5 مل من كريوفيالات مثلجة. ضع cryovials في وعاء تجميد.
   2. قم بتخزين الحاوية عند -80 درجة مئوية O / N. انقله إلى النيتروجين السائل. قم بإذابة قارورة من MSC (اتبع الخطوات 1.3.1 - 1.3.6). أعد تعليق MSC في وسط استزراع 5 مل (اختر الوسط المناسب ل WJMSC أو BMMSC) والبذور في قارورة 25 سم².

< p class = "jove_title" >2. إنشاء مزارع مشتركة للخلايا الجذعية البطانية والوسيطة على المرشحات

1. افصل WJ أو BMMSC كما هو موضح في القسم 1.4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل MSCGM. قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو مقياس الخلوي.
2. اضبط مستوى الصوت بحيث يكون التركيز النهائي 5 × 10⁵ MSC في 500 ميكرولتر من MSCGM.
3. باستخدام ملقط معقم ، اقلب مرشحات ترانسويل PET 6 بئر ، 0.4 ميكرومتر وضعها في صندوق معقم.
4. ضع البذور 5 × 10⁵ MSC على السطح الخارجي للمرشحات. احتضان المرشحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعة واحدة.
5. اجمع الوسائط من السطح الخارجي للمرشح. احسب عدد MSCs غير الملتزمة في الوسائط. أعد قلب المرشحات باستخدام ملقط معقم وضعها في صفيحة متطابقة من 6 آبار تحتوي على 3 مل MSCGM.
6. أضف 2 مل من MSCGM على السطح الداخلي للفلتر (الشكل 1 ب). ضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة. قم بتربسين قارورة ملتقية مقاس 25 سم² من EC (الشكل 1Ai ؛ كقسم 1.4).
7. أعد تعليق EC في 8 مل MSCGM (1 × 25 سم² قارورة ستزرع أربعة مرشحات 6 آبار ؛ ~ 5 × 10⁵ EC / مرشح). وسط الشفط من أعلى وأسفل المرشحات المسامية. أضف 3 مل من MSCGM الطازج إلى الحجرة السفلية (أسفل الفلتر). أضف 2 مل من تعليق EC إلى السطح الداخلي لكل مرشح. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
8. شفط وسط لغسل EC غير الملتصق واستبداله ب MSCGM الطازج. قم بإعداد مرشحات EC أحادية الثقافة المتوازية عن طريق بذر الخلايا على السطح الداخلي دون بذر MSC أولا. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
9. تأكد من أن الطبقة الأحادية EC ملتصقة ولا تحتوي على فجوات. لا يمكن استخدام الطبقات الأحادية الفرعية المتوافقة لمقايسات الالتصاق (الشكل 1 ب).
10. قم بإذابة 1 × 10⁵ U / ml عامل نخر الورم ألفا (TNFα) وقم بتخفيف 1: 1,000 في MSCGM إلى تركيز نهائي يبلغ 100 U / مل (ما يعادل ~ 10 نانوغرام / مل). قم بإجراء تخفيف تسلسلي عن طريق تخفيف 100 وحدة / مل TNFα بمقدار 1:10 في MSCGM للحصول على 10 U / ml. خفف 10 U / ml TNFα بمقدار 1:10 في MSCGM للحصول على 1 U / ml.
11. عالج الغرف العلوية والسفلية للمرشحات ب 1 أو 10 أو 100 وحدة / مل TNFα (ما يعادل ~ 10 نانوغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل الفحص.

< p class = "jove_title" >3. عزل الكريات البيض

1. خذ الدم الوريدي من المتطوعين الأصحاء وقم بنقلها على الفور إلى أنابيب EDTA. اقلب الأنابيب برفق للخلط.
2. طبقة 2.5 مل هيستوباك 1077 على 2.5 مل هيستوباك 1119 في أنبوب دائري القاع سعة 10 مل. ضع طبقة 5 مل من الدم الكامل على التدرج الهيستوباك. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 40 دقيقة في RT.
3. حصاد العدلات النووية الطرفية متعددة الأشكال (PMN) في واجهة الهيستوباك 1077 و 1119 (فوق طبقة كريات الدم الحمراء). ضعيها في أنبوب دائري القاع سعة 10 مل ومكياجيه حتى 10 مل مع PBSA. اقلب الأنبوب وجهاز الطرد المركزي برفق عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
4. تمييع محلول BSA 7.5٪ 1:50 في 100 مل PBS (مع كلوريد الكالسيوم والمغنيسيوم) إلى تركيز نهائي قدره 0.15٪ (وزن / حجم ؛ PBSA). شفط طافي وتعليقه في 10 مل PBSA. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
5. أعلق في 1 مل PBSA. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية وأضفه إلى 380 ميكرولتر PBSA (تخفيف 1:20). عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو مقياس الخلوي. خفف إلى التركيز المطلوب (1 × 10⁶ / مل لمرشحات Transwell و Ibidi microslide) في PBSA. حافظ على تعليق العدلات في RT حتى الفحص.

< p class = "jove_title" >4. تجميع نظام التدفق

1. قم بإعداد نظام التدفق كما هو موضح في الشكل 1C. قم بتشغيل السخان واضبطه على 37 درجة مئوية. قم بتوصيل حقنة سعة 20 مل (قم بإزالة المكبس) وحقنة سعة 5 مل بنقرة ثلاثية الاتجاهات. قم بتوصيل الصنبور بغرفة Perspex باستخدام شريط Micropore.
2. قم بقياس وقطع قطعة طويلة من السيليكون 2/4 مم (سميكة) الأنابيب التي تساوي تقريبا المسافة بين الصمام والصنبور ثلاثي الاتجاهات. قم بقص قطعة بطول 8-10 مم من أنبوب 1/3 مم (رفيع) وأدخلها في أحد طرفي الأنبوب السميك. قم بتوصيل جانب الأنبوب السميك على الصنبور ثلاثي الاتجاهات.
3. قم بتوصيل طرف الأنبوب الرفيع بمنفذ الصمام الدقيق الإلكتروني ثلاثي الاتجاهات. هذا هو "خزان الغسيل". قطع قطعة بطول 6-8 مم من الأنابيب السميكة والرقيقة.
4. أدخل الأنبوب الرفيع في أحد طرفي الأنبوب السميك. قم بتوصيل طرف الأنبوب السميك بحقنة سعة 2 مل (قم بإزالة المكبس).
5. قم بتوصيل طرف الأنبوب الرفيع للحقنة سعة 2 مل بمنفذ على الصمام الدقيق الإلكتروني لعمل "خزان العينة". قم بتوصيل الصمام بغرفة تدفق المرشح عن طريق قياس وقطع قطعة طويلة من الأنابيب الرقيقة وهي المسافة بين الصمام الدقيق ومركز مرحلة المجهر.
6. بالنسبة لنموذج الشريحة الدقيقة ، قم بإرفاق قطعة من الأنابيب السميكة مقاس 8 - 10 مم بنهاية الأنبوب الرفيع. ضع موصلا على شكل حرف L في نهاية الأنبوب السميك. سيتصل هذا بالشريحة الصغيرة. بالنسبة لطراز المرشح ، قم بإرفاق قطعة من 8 إلى 10 مم من مقياس ضغط الخط الأزرق Portex لتوصيل الأنبوب بنهاية الأنبوب الرفيع.
7. ضع طرف الأنبوب الرفيع على الصمام الدقيق. هذا هو الناتج المشترك لخزانات الغسيل والعينات. املأ الخزانات ب PBSA. الأنابيب الرئيسية عن طريق تدفق PBSA من خلالها لإزالة أي فقاعات هواء.
8. قم بتوصيل أنبوب مقياس الضغط بحقنة زجاجية مقاس 29 مم (50 مل). قم بتجهيز المحقنة عن طريق ملئها ب 10 مل PBSA. اقلب المحقنة بحيث تكون النهاية المتصلة بالأنبوب متجهة لأعلى وادفع جميع فقاعات الهواء للخارج. أعد التعبئة ب 5 مل PBSA.
9. بالنسبة لطراز microslide فقط ، قم بتوصيل قطعة من الأنابيب السميكة مقاس 10 إلى 12 مم بنهاية أنبوب Manometer المؤدي إلى المحقنة الزجاجية. ضع موصل على شكل حرف L في نهاية الأنبوب السميك. ضع المحقنة الزجاجية في مضخة حقنة للتسريب / السحب.
10. احسب معدل تدفق إعادة الملء (Q) المطلوب لتوليد إجهاد قص الجدار المطلوب (τ_w في باسكال ، باسكال) البالغ 0.1 باسكال (مرشحات Transwell) أو 0.05 باسكال (الشرائح الدقيقة Ibidi) باستخدام الصيغ التالية:
    γ_ث = (6. س) / (الساعة²)
    τ = n.γ
    حيث w = العرض الداخلي و h = العمق الداخلي لقناة التدفق. ن = لزوجة المحلول المتدفق ؛ PBSA هو n = 0.7 mPa.s. بالنسبة لغرفة تدفق مرشح اللوحة المتوازية ، يبلغ العرض (w) 4 مم والعمق (h) 0.133 مم. يمكن أن يختلف عمق الغرفة قليلا بسبب الاختلافات في سمك حشية Parafilm المستخدمة. بالنسبة للشريحة الصغيرة Ibidi ، يبلغ العرض 3.8 مم والعمق 0.4 مم
    ملاحظه: نظرا للاختلافات في أبعاد قناة التدفق وديناميكيات الالتقاط ، نستخدم ضغوط قص مختلفة لنموذج الشريحة الدقيقة مقارنة بنموذج المرشح.

< p class = "jove_title" >5. إعداد غرفة تدفق اللوحة المتوازية التي تتضمن المرشحات

1. قص قطعة من Parafilm (بنفس حجم الغطاء الزجاجي) باستخدام قالب معدني. قم بقص فتحة مقاس 20 × 4 مم في Parafilm (لإنشاء قناة التدفق) باستخدام قالب معدني. استخدم الحشية لتمييز قناة التدفق على الغطاء الزجاجي.
2. قم بمحاذاة حواف المرشح المكون من 6 آبار على الغطاء الزجاجي. تأكد من أن المرشح يغطي علامات قناة التدفق. قم بقص الفلتر بعناية باستخدام مشرط من النوع 10A.
3. قم بتغطية الفلتر بعناية بحشية Parafilm ، مع التأكد من أن فتحة قناة التدفق في منتصف المرشح (الشكل 1D). استخدم قطعة من المناديل النظيفة وادفع أي فقاعات.
4. ضع الغطاء في تجويف اللوحة السفلية لغرفة تدفق Perspex. ضع لوحة Perspex العلوية فوق الجزء العلوي من الحشية وقم بربط الألواح معا (الشكل 1 د).
5. أدر الصنبور ثلاثي الاتجاهات للسماح للمخزن المؤقت للغسيل (PBSA) بالتدفق عبر الصمام. قم بتوصيل أنبوب Manometer بمنفذ مدخل لوحة Perspex العلوية. قم بتشغيل PBSA عبر قناة التدفق للسماح للفقاعات بالمرور.
6. قم بتوصيل أنبوب مقياس الضغط من مضخة الحقنة بمنفذ مخرج لوحة Perspex. اضبط مضخة المحقنة على إعادة التعبئة واضغط على تشغيل. نظف أي PBSA تقطر على اللوحة العلوية من الغرفة.
7. ضع الغرفة على مسرح مجهر تباين الطور المقلوب. اضبط التركيز لتصور EC فوق المرشحات (الشكل 1 ب).

< p class = "jove_title" >6. نضح الكريات البيض على الخلايا

البطانية

1. ضع 2 مل من العدلات المنقاة في خزان العينة واتركها لتسخن لمدة دقيقتين. اغسل البطانة باستخدام PBSA لمدة دقيقتين.
2. قم بتشغيل الصمام لاختراق العدلات فوق البطانة. توصيل بلعة العدلات لمدة 4 دقائق. قم بإيقاف تشغيل الصمام وقم ببث PBSA من خزان الغسيل للفترة المتبقية من التجربة.
3. تأكد من أن فقاعات الهواء لا تمر عبر قناة التدفق في أي وقت أثناء الفحص لأن هذا سيؤدي إلى تعطيل الطبقة الأحادية EC ويؤدي إلى انفصال العدلات الملتصقة.

< p class = "jove_title" >7. تسجيل التقاط العدلات وسلوكها

1. سجل تجنيد العدلات إما أثناء تدفق العدلات أو بعد التروية.
2. قم بعمل جميع التسجيلات الرقمية لما لا يقل عن 5 - 10 حقول في وسط قناة التدفق. حدد مركز القناة عن طريق تحريك الهدف إلى حافة القناة عند منفذ المدخل وتحديد منتصف المنفذ.
   1. للتسجيل أثناء تدفق العدلات ، التقط صورا لحقل واحد كل 10 ثوان لمدة دقيقة واحدة. كرر طوال مدة البلعة.
   2. لتسجيل ما بعد التروية ، قم بإجراء تسجيلات مدتها 10 ثوان من 5 إلى 10 حقول أسفل مركز قناة التدفق لتقييم سلوك الكريات البيض (عادة بعد دقيقتين من نهاية بلعة العدلات). التقط صورا كل ثانية خلال الفاصل الزمني البالغ 10 ثوان. يتيح ذلك وقتا كافيا لتحليل الالتقاط من التدفق وسلوك العدلات الملتصقة.
   3. سجل حقلا واحدا يحتوي على ما لا يقل عن 10 عدلات منقولة لمدة 5 دقائق ، مع التقاط الصور كل 30 ثانية. يمكن استخدام هذا لحساب سرعة الخلايا المهاجرة (إما فوق البطانة أو تحتها).
   4. سجل سلسلة أخرى من الحقول التي تبلغ مدتها 10 ثوان (عادة 9 دقائق بعد التروية). هذا يسمح للعدلات بالوقت للهجرة عبر الطبقة الأحادية البطانية.
   5. أوقف مضخة الحقنة وقم بإزالة الأنبوب. قم بتفكيك غرفة التدفق واشطف خزان العينة والأنابيب. كرر مع المرشحات اللاحقة/قنوات microslide.

8. تحليل تجنيد الكريات البيض وسلوكها

1. احسب عدد العدلات في كل حقل خلال التسجيلات التي تبلغ مدتها 10 ثوان عند النقطة الزمنية التي تبلغ دقيقتين. يجب أن تكون جميع الخلايا موجودة في الحقل الأول والثانية حتى يتم حسابها. يتم تضمين الخلايا الموجودة جزئيا في الحقل على جانبين (على سبيل المثال، الحد العلوي/الأيمن) من مجال الرؤية في العدد، طالما أنها تبقى في الحقل لمدة 10 ثوان كاملة.
2. احسب متوسط عدد العدلات الملتصقة لكل حقل. قم بقياس طول وعرض الحقل المسجل. احسب مساحة الحقل. احسب عدد الحقول الموجودة في 1 مم². اضرب متوسط عدد العدلات في عدد الحقول في 1 مم².
3. احسب العدد الإجمالي للعدلات المنفعة بضرب كمية العدلات المنخرفة (على سبيل المثال ، 2 × 10⁶ / مل * Q [على سبيل المثال ، 0.0999 مل / دقيقة لغرفة تدفق اللوحة المتوازية]) في مدة البلعة (على سبيل المثال ، 4 دقائق).
4. اقسم عدد العدلات / مم² على العدد الإجمالي للعدلات المنقعة لتحديد العدد الإجمالي للخلايا الملتصقة (الخلايا الملتصقة / مم² / 10⁶ منفوخة).
5. تقييم ما إذا كانت العدلات الملتصقة تتدحرج أو ملتصقة بقوة أو منقولة.
   1. العدلات المتدحرجة هي طور مشرق وسوف تتحرك ببطء على طول الطبقة الأحادية البطانية (1 - 10 ميكرومتر / ثانية).
   2. الخلايا الملتصقة بقوة تكون ساطعة الطور ومرتبطة بسطح EC ، إما أن تظل ثابتة (أي لا تتحرك أثناء التسجيل) أو خضعت لتغيير الشكل وتهاجر فوق سطح EC (الشكل 1Ei).
   3. العدلات المنقولة هي طور مظلمة وتحت طبقة EC (الشكل 1Eii).
6. احسب النسبة المئوية للخلايا الملتصقة المتدحرجة والثابتة والمتنقلة. بدلا من ذلك ، يمكن التعبير عن سلوك العدلات كإجمالي لأعداد الخلايا التي تظهر السلوكيات المختلفة من خلال تطبيق نفس الصيغة المستخدمة لحساب الالتصاق الكلي (كما هو موضح في الخطوات 8.6 - 8.7).
   1. ضع علامة على الحافة الأمامية للعدلات المتدحرجة. ضع علامة على الحافة الأمامية لنفس الخلية في نهاية التسلسل الذي مدته 10 ثوان. ارسم خطا بين النقطتين وقم بقياس المسافة التي قطعتها الخلية.
   2. اقسم هذه القيمة على مدة التسجيل التي تتدحرج فيها الخلية (أي 10 ثوان). حاول تحديد العدلات الموجودة في الميدان طوال فترة 10 ثوان.
7. لحساب سرعة العدلات المهاجرة فوق السطح (الشكل ، الطور المتغير الساطع) أو تحت البطانة (الطور المظلم) ، استخدم التسجيل لمدة 5 دقائق.
   1. ارسم مخططا تفصيليا للخلايا التي تم ترحيلها في بداية التسلسل وتتبع تحركاتها طوال التسلسل. قم بتدوين مواضع X و Y للنقطة الوسطى في كل فاصل زمني مدته دقيقة واحدة لكل خلية. اطرح قيم المواضع X وY من الصورة الأولى للتسلسل من القيم الموجودة في الصورة الثانية. يعتمد هذا على نظرية فيثاغورس.
   2. اطرح القيم من الصورة الثانية من الصورة الثالثة. افعل ذلك لجميع الصور في التسلسل. تربيع قيمتي X و Y واجمعهما معا.
   3. الجذر التربيعي للقيمة الناتجة. احسب السرعة لكل خلية عن طريق حساب متوسط السرعات المحسوبة في كل فاصل زمني بالدقيقة. تتبع 10 عدلات مهاجرة واحسب متوسط السرعة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. إنشاء ثقافة مشتركة EC-MSC وتحليل تجنيد العدلات باستخدام مقايسة الالتصاق القائم على التدفق. (أ) صورة مجهرية ل (i) EC الأولي و (ii) ممر 3 BMMSC نمت على قوارير زراعة الأنسجة. (ب) صورة مجهرية ل EC و MSC مستزرعة على إدخالات مرشح Transwell ذات 6 آبار. (ج) رسم تخطيطي لنظام التروية المستخدم لتوليد التدفق. (د)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نوع الكولاجيناز Ia سيغما سي 2674 خفف في 10 مل PBS للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 1 مل. برنامج تلفزيون Dulbecco سيغما د8662 مع كلوريد الكالسيوم والمغنيسيوم. يحفظ معقما ويخزن في درجة حرارة الغرفة. 1X متوسط M199 جيبكو 31150-022 يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. كبريتات الجنتاميسين سيغما جي 1397 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أضفه إلى زجاجة M199 500 مل. عامل نمو البشرة البشري سيغما E9644 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 10 ميكرولتر. مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) سيغما F9665 يجب اختبار FCS على دفعات لضمان نمو وصلاحية EC المعزول. الأمفوتريسين ب جيبكو 15290-026 قوي ويصبح ساما في غضون أسبوع ، لذا يجب تعويض وسط HUVEC الكامل الطازج كل أسبوع. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 1 مل. الهيدروكورتيزون سيغما H0135 المخزون في الإيثانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 10 ميكرولتر. الكولاجيناز النوع الثاني سيغما [ك6885] يخفف المرق في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100 مجم / مل. يحفظ في -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر من الكميات المئوية. الهيالورونيداز سيغما H3631 خفف المرق في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 20,000U / ml. يحفظ في -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر من الكميات الصغيرة. مصفاة خلية 100 ميكرومتر لأنبوب الطرد المسنتي 50 مل مستلزمات المختبرات العلمية (SLS) هاتف: 352360 يمكن أيضا استخدام مصافي الخلايا الأخرى المتاحة تجاريا (مثل Greiner bio-one). DMEM منخفض الجلوكوز بيوسيرا LM-D1102/500 يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. مزيج البنسلين / الستربتومايسين سيغما ص 4333 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 1 مل. قارورة زراعة الأنسجة 25 سم 2 SLS 353109 قارورة زراعة الأنسجة 75 سم 2 SLS 353136 قارورة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم لونزا PT-2501 يحفظ في النيتروجين السائل عند الوصول. توجد الزنازين عند الممر 2 عند الوصول ولكن تم تعيينها على أنها ممر 0. Exapand إلى المرور 3 وتخزينها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. وسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCGM) لونزا بي تي -3001 يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. بالنسبة إلى Cell Tracker Green تلطيخ ، استخدم الوسط بدون FCS. حل EDTA (0.02٪) سيغما E8008 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. محلول التربسين سيغما تي 4424 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 2 مل. قم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة واستخدمه على الفور. Cryovials Greiner bio-one 2019-02 يحفظ على الثلج قبل الإضافة قبل إضافة معلق الخلية. حاوية التجميد السيد فروستي نالجين 5100-0001 يحفظ في درجة حرارة الغرفة. عند إضافة المبردات مع تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل. صبغة خضراء تعقب الخلية تقنيات الحياة [ك2925] يحفظ في 5 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية. خفف في 5 مل مسخن مسبقا (عند 37 درجة مئوية) MSCGM. غرف عد الخلايا نكسل إس دي-100 بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مقياس الدم. عداد خلية T4 التلقائي مقياس cellometer نكسل تلقائي T4-203-0238 عامل نخر الورم α (TNFα) أنظمة البحث والتطوير 210-TA-100 خفف المرق في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100,000U / ml. يخزن في -80 درجة مئوية في 10 ميكرولتر. مرشحات PET Transwell 6 بئر ، 0.4 ميكرومتر SLS 353090 K2-EDTA في أنابيب 10 مل سارستيدت يحفظ في درجة حرارة الغرفة. تاريخ 1119 سيغما هاتف: 11191 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. هيستوباك 1077 سيغما هاتف: 10771 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. أنبوب دائري القاع 10 مل أبليتون وودز SC211 142 ك 7.5٪ حل BSA Fraction V تقنيات الحياة هاتف: 15260-037 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. 20 مل محاقن Plastipak صقر BD 300613 5 مل محاقن Plastipak صقر BD 302187 2 مل محاقن بلاستيباك صقر BD 300185 شريط جراحي مضاد للحساسية 3M 9 م × 2.5 سم المسام الدقيقة 1530-1 استخدمه لتثبيت صنبور المحقنة على جدار حجرة البرسبيكس. أنابيب مطاطية من السيليكون ، القطر الداخلي / القطر الخارجي (ID / OD) 1/3 مم (أنبوب رفيع) فيشر ساينتيك FB68854 قطع أنابيب السيليكون بالحجم المناسب. يجب أن تكون جميع الأنابيب المؤدية مباشرة إلى الصمام الدقيق الإلكتروني رقيقة. معرف أنابيب مطاط السيليكون / OD من 2/4 مم (أنابيب سميكة) فيشر ساينتيك FB68855 أنابيب مقياس ضغط الخط الأزرق Portex الحدادون 200/495/200 الأنابيب المؤدية إلى مضخة المحقنة. 3-طريقة محبس BOC Ohmeda AB حقنة زجاجية 50 مل للمضخة بوبر ميكروميت 550962 يجب تحضيره قبل الاستخدام عن طريق إزالة أي فقاعات هواء. غطاء زجاجي ريموند لامب أغطية مقاس 26 × 76 مم حسب الطلب. رقم الدفعة 2440980. حشية بارافيلم شركة العلب الوطنية الأمريكية قم بقص قطعة من البارافيلم مقاس 26 × 76 مم باستخدام قالب من الألومنيوم وقم بقص فتحة 20 × 4 مم فيها باستخدام مشرط 10 أمبير. سمك الحشية حوالي 133 ميكرومتر. لوحان متوازيان من البرسبيكس مختبر وولفسون للتكنولوجيا التطبيقية غرفة مصممة خصيصا تتكون من ألواح متوازية مثبتة معا بواسطة 8 براغي. تحتوي اللوحة السفلية على فتحة عرض مقطوعة في المنتصف وتجويف ضحل مطحون لإتاحة مساحة للغطاء والفلتر والحشية. تحتوي لوحة البرسبيكس العلوية على فتحة مدخل ومخرج موضوعة فوق قناة التدفق. صمام كهربائي إلكتروني ثلاثي الاتجاهات مع الحد الأدنى للمساحة الميتة لي برودكتس المحدودة LFYA1226032H متصل إلكترونيا بمصدر طاقة 12 فولت تيار مستمر. مضخة حقنة للتسريب / السحب (PHD2000) جهاز هارفارد 70-2001 اضبط القطر على 29 مم ومعدل إعادة التعبئة (التدفق). موصل على شكل حرف L لابوت جنيه876 للتوصيل بمنافذ المدخل والمخرج على قناة Ibidi microslide. كاميرا فيديو التصوير البسيط 01 - كيو آي سي - ف - م - 12 - ج متصل بجهاز كمبيوتر يتيح تسجيل مقاطع الفيديو الرقمية بالكامل. كاميرا image-Pro Plus 7.0 علم التحكم الآلي في وسائل الإعلام 41N70000-61592 لتحليل البيانات. وضع علامات يدويا على الخلايا التي تعرض السلوكيات المختلفة. تتبع الخلايا لتحليل سرعات التدحرج والترحيل.