القياس الكمي القائم على قياس التدفق الخلوي للخلايا السرطانية الشائخة التي يسببها العلاج

الملخص

المصدر: Flor، A.، et al. مسبار الشيخوخة الفلورية الفارقة المرتبطة ب β-galactosidase لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الشائخة عن طريق قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو مقايسة قائمة على قياس التدفق الخلوي لقياس الخلايا السرطانية الشائخة التي يسببها العلاج بعلامات الشيخوخة المزدوجة. يتضمن الكشف عن الخلايا الشائخة وقياسها باستخدام ركيزة β-galactosidase. يتم شق الركيزة بواسطة β-galactosidase الليزوزومي النشط داخل الخلايا السائدة ، مما ينتج عنه منتج فلوري ، جنبا إلى جنب مع حبيبات ليبوفوسين الفلورية الذاتية ، يميز الخلايا السرطانية الشائخة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحريض الشيخوخة بواسطة أدوية العلاج الكيميائي في الخلايا السرطانية المستنبتة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات التلاعب بالخلايا في هذا القسم في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام ممارسات معقمة. هذا القسم مكتوب لأنواع الخلايا الملتصقة. يمكن استخدام خلايا التعليق مع التعديلات المناسبة كما هو مذكور.

1. قم بزراعة خط (خطوط) الخلايا السرطانية وفقا للبروتوكول القياسي من المورد أو المختبر الذي قدم خط (خطوط) الخلايا المحددة المستخدمة.
   ملاحظه: يفضل بشكل عام خلايا المرور المنخفضة (ص < 10) حيث ستكون هناك مستويات أقل من الشيخوخة التكاثرية ، أي الخلفية السفلية ، في عينات الخلايا غير المعالجة.
2. قبل يوم واحد من تحريض الشيخوخة عن طريق الأدوية ، قم بحصاد الخلايا التي تحتوي على التربسين-EDTA 0.25٪ (أو على النحو الموصى به). قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الثقافة الكامل ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي معقم.
   ملاحظه: هذه الخطوة ليست ضرورية لخلايا التعليق.
3. عد الخلايا باستخدام طريقة مقياس الدم القياسية وسجل الخلايا / مل. خلايا الألواح في 1 × 10 3-10 ×^{10 3} خلايا / سم² في أطباق الاستزراع البلاستيكية القياسية المكونة من 6 آبار.
   ملاحظه: تعتمد كثافة الطلاء المثلى على معدل تكاثر الخلايا ويجب أن يحددها المستخدم. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة النمو في مرحلة السجل عند التقاء حوالي 10٪ -20٪ في وقت العلاج (أي بعد 18-24 ساعة من الحضانة بعد الطلاء). يجب تحديد كثافة البداية (الخلايا / مل) لخلايا التعليق من قبل المستخدم. عادة ما تنتج الألواح المكونة من ستة آبار ما يكفي من الخلايا الشائخة لكل بئر لعينة واحدة من تحليل قياس التدفق الخلوي القياسي. في حالة فرز التدفق ، يجب استخدام مساحة سطح أكبر بكثير (على سبيل المثال ، لوحات P150 متعددة) لتمكين استعادة أعداد كافية من الخلايا الشائخة لفحوصات المصب (≥1 × 10⁶).
4. احتضان الخلايا المطلية طوال الليل (18-24 ساعة) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ووعاء الرطوبة.
5. عالج الخلايا المطلية بأدوية (أدوية) العلاج الكيميائي المحفز للشيخوخة. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي واحد على الأقل ، على سبيل المثال ، إيتوبوسيد (ETO) أو بليومايسين (BLM). تحضير آبار مكررة لكل دواء. قم بتضمين مجموعة واحدة تعامل مع السيارة فقط كعنصر تحكم.
   ملاحظه: يجب أن يختبر المستخدم منحنى الجرعة لكل عامل تجريبي لتحديد التركيز الأمثل لتحريض الشيخوخة في خط (خطوط) الخلايا المستخدمة.
6. احتضان الخلايا لمدة 4 أيام في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ووعاء رطوبة للسماح ببداية الشيخوخة. افحص يوميا بحثا عن التغييرات المورفولوجية المتوقعة باستخدام المجهر الضوئي.
   ملاحظه: قد تكون أوقات الحضانة من 3-5 أيام مقبولة اعتمادا على معدل ظهور الشيخوخة. يمكن تغيير الوسائط وإعادة تطبيق العامل (أو لا) ، حسب الرغبة ، لتعزيز ظروف النمو الصحية مع تحقيق نسبة مقبولة من الخلايا القديمة.
7. بعد بداية الشيخوخة ، احصد الخلايا بإضافة التربسين-EDTA 0.25٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما يتم تفكيك الخلايا في معلق ، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من الوسط الكامل.
   ملاحظه: هذه الخطوة ليست ضرورية للخلايا التي تنمو في حالة تعليق. إذا تم إجراء تلطيخ علامة السطح ، فتجنب استخدام التربسين-EDTA لأنه يمكن أن يدمر مؤقتا المستضدات السطحية على الخلايا. بدلا من ذلك ، قم بفصل الطبقة الأحادية برفق باستخدام مكشطة خلية بلاستيكية معقمة (أو كاشف تفكك بديل مصمم للحفاظ على المستضدات السطحية).
8. عد الخلايا في كل عينة باستخدام مقياس الدم. احسب الخلايا / مل لكل عينة.
   ملاحظه: يمكن إضافة التريبان الأزرق لتقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة في هذه المرحلة (أي بسبب العلاج بالعقاقير) ، ولكن سيتم أيضا تحديد موت الخلايا باستخدام صبغة الفلورسنت القابلة للحياة أثناء سير عمل تلطيخ DDAOG.
9. Aliquot ≥0.5 × 10⁶ خلايا لكل عينة في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل.
   ملاحظه: يجب توحيد عدد الخلايا لكل عينة عبر جميع العينات.
قم
10. بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية
    ملاحظه: إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي الدقيق المبرد متاحا ، فقد يكون من المقبول إجراء عمليات الطرد المركزي في درجة الحرارة المحيطة لأنواع معينة من الخلايا المرنة.
11. انتقل إلى تلطيخ DDAOG في القسم 2.

< p class = "jove_title" >2. تلطيخ DDAOG ل SA-β-Gal في عينات الخلايا

1. قم بتخفيف مخزون 1 ملي مولار من بافيلومايسين A1 عند 1: 1,000x في وسط DMEM (بدون FBS) للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر.
2. أضف محلول Baf-DMEM المحضر إلى عينات حبيبات الخلية (من الخطوة 1.11) بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / مل
   ملاحظه: على سبيل المثال، إذا كنت تستخدم 0.5 × 10⁶ خلايا لكل عينة، أضف 0.5 مل من Baf-DMEM.
3. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (بدون_{ثاني أكسيد الكربون 2}) على دوار / شاكر مضبوطة بسرعة بطيئة.
   ملاحظه: تجنب حاضنات ثاني أكسيد الكربون₂ لعملية التلوين ، والتي يمكن أن تحمض المحاليل وبالتالي تتداخل مع تلطيخ Baf و DDAOG.
4. بدون غسيل، أضف محلول مخزون DDAOG (5 ملغ/مل) عند 1:500x (10 ميكروغرام/مل نهائي) إلى كل عينة. ماصة للخلط. استبدل على دوار / شاكر عند 37 درجة مئوية (بدون_{ثاني أكسيد الكربون 2}) لمدة 60 دقيقة. حماية من الضوء المباشر.
قم
5. بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
6. يغسل ب 1 مل من BSA المثلج 0.5٪ لكل أنبوب وماصة للخلط. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x لغسل الخلايا جيدا. قم بإزالة المادة الطافية وتابع.
   ملاحظه: من المهم تنفيذ خطوات الغسيل في الخطوة 2.6 لإزالة DDAOG غير المشقوق ، والذي يمكن أن يظهر انبعاثا مضاليا غير مرغوب فيه (460/610 نانومتر).
7. (اختياري) تثبيت وتخزين الخلايا الملطخة ب DDAOG لتحليلها لاحقا
   1. أضف 0.5 مل من المثلج البارد بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد بالتنقيط إلى كل عينة مغسولة. ماصة للخلط.
   2. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. اغسل الخلايا 2x مع 1 مل من PBS.
   4. قم بتخزين العينات لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية قبل تحليل قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظه: بالنسبة للعينات الثابتة، تخطي الخطوة 2.8.
8. قم بتخفيف مخزون Calcein Violet 450 AM (1 ملم) عند 1: 1,000x إلى 1٪ BSA-PBS (1 ميكرومتر نهائي). أضف 300 ميكرولتر (لعينات الخلايا المستزرعة) إلى كريات الخلية المغسولة من الخطوة 2.6. احتضن لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
9. انتقل إلى إعداد قياس التدفق الخلوي (القسم 3).

< p class = "jove_title" >3. إعداد مقياس التدفق الخلوي والحصول على البيانات

1. انقل عينات الخلية إلى أنابيب متوافقة مع أداة قياس التدفق الخلوي. ضع الأنابيب على الجليد واحتفظ بها محمية من الضوء.
   ملاحظه: إذا لوحظت وجود مجاميع في معلقات الخلية ، فقم بتمرير التعليق عبر مصافي الخلايا 70-100 ميكرومتر قبل التحليل. لا تستخدم مصافي 40 ميكرومتر لأنها يمكن أن تستبعد بعض الخلايا القديمة.
2. في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) ، افتح المخططات التالية: 1) FSC-A مقابل SSC-A مخطط نقطي ، 2) الرسم البياني للقناة البنفسجية ، 3) القناة الحمراء البعيدة (على سبيل المثال ، APC-A) مقابل القناة الخضراء (على سبيل المثال ، FITC-A) مخطط نقطي.
   ملاحظه: يمكن أيضا استخدام مخططات الاستبعاد المزدوجة والرسوم البيانية أحادية القناة ولكنها ليست مطلوبة بشكل صارم.
3. بدء الحصول على بيانات مقياس الخلوي.
   1. ضع عينة التحكم الخاصة بالسيارة فقط الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بسرعة سحب منخفضة ، ابدأ في الحصول على بيانات العينة.
   2. اضبط جهد FSC و SSC بحيث يتم احتواء >90٪ من الأحداث داخل المؤامرة. إذا لم تتناسب الخلايا جيدا مع المخطط، فقم بخفض إعداد قياس المنطقة إلى 0.33-0.5 وحدة.
   3. قم بإزالة عينة السيارة فقط دون تسجيل البيانات.
   4. (اختياري) أضف قطرة واحدة من مجهريات معايرة قوس قزح إلى أنبوب مقياس الخلوي مع 1 مل من PBS. ضع الأنبوب على منفذ سحب مقياس الخلوي. ابدأ في الحصول على عينة من البيانات.
   5. اضبط جهد القناة البنفسجي والأخضر والأحمر البعيد بحيث تكون الذروة العلوية لمجهرية قوس قزح في حدود 104-105 وحدة من التألق النسبي في كل قناة ويتم فصل جميع القمم جيدا في كل قناة. سجل 10,000 حدث. قم بإزالة الأنبوب.
4. ضع عينة التحكم الإيجابية (على سبيل المثال ، BLM ، ETO) ملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بسرعة منخفضة ، احصل على عينة من البيانات. راقب الأحداث في قنوات FSC و SSC و البنفسجي والأخضر والأحمر البعيد للتأكد من احتواء أكثر من 90٪ من الأحداث في جميع قطع الأراضي. ابحث عن زيادة في إشارة التركيز البؤري التلقائي و DDAOG مقابل التحكم في السيارة فقط.
5. إذا كنت تستخدم مقياس الخلوي للفرز ، فابدأ الفرز في هذه الخطوة.
   1. لأغراض حفظ السجلات، قم بتسجيل 10,000 خلية لعينة التحكم وكل عينة تم فرزها.
   2. قم بفرز الكمية المطلوبة من الخلايا (≥1 × 10⁶ مناسبة عادة) في أنبوب تجميع مناسب للأداة مع 3-5 مل من وسط الاستزراع.
   3. بعد الفرز ، انتقل إلى الثقافة أو التحليل.
      ملاحظه: بالنسبة لمقياس التدفق الخلوي المعاير المستخدم هنا ، انخفضت الفولتية المثلى للقناة عادة بين 250 و 600 (المدى المتوسط) ، لكن الفولتية المثلى ونطاقات جهد القناة ستختلف عبر الأدوات. تجنب استخدام الفولتية في نطاقات منخفضة جدا أو عالية ، مما قد يثبط الإشارة أو يضخم الضوضاء.
6. بعد إكمال الخطوات 3.1-3.5 وإجراء تعديلات على إعدادات مقياس الخلايا حسب الضرورة ، قم بتسجيل البيانات لجميع العينات. تأكد من بقاء الإعدادات موحدة لجميع عينات التسجيلات. سجل ≥10,000 حدث لكل عينة خلية مستزرعة.
   ملاحظه: على الرغم من أنه يمكن إجراء البوابات والتحليل باستخدام برنامج الحصول على البيانات (على سبيل المثال ، FACSDiva) ، إلا أن سير عمل البوابة والتحليل الكامل الذي سيتم إجراؤه بعد الاستحواذ باستخدام برنامج تحليل منفصل (FlowJo) موصوف في القسم 4 أدناه. يفضل تحليل ما بعد الاستحواذ لتقليل الوقت في محطة عمل مقياس الخلايا والاستفادة من الأدوات الإضافية المضمنة في برنامج التحليل المخصص.
7. حفظ بيانات العينة بتنسيق ملف .fcs. قم بتصدير الملفات إلى جهاز كمبيوتر محطة عمل مزود ببرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال ، FlowJo).

< p class = "jove_title" >4. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يستخدم سير العمل المقدم برنامج FlowJo. يمكن استخدام برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي البديل إذا تم اتباع الخطوات الرئيسية الموضحة في هذا القسم بالمثل.

1. باستخدام برنامج FlowJo ، افتح ملفات بيانات .fcs من الخطوة 3.7.
2. افتح نافذة التخطيط.
3. قم بسحب جميع العينات وإفلاتها في نافذة التخطيط.
4. بوابة الخلايا القابلة للحياة.
   1. انقر أولا نقرا مزدوجا فوق عينة البيانات الخاصة بعنصر التحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها.
   2. تصور البيانات كرسم بياني للقناة البنفسجية. حدد الخلايا القابلة للحياة الملطخة ب CV450 بناء على تألقها الأكثر إشراقا من الخلايا الميتة.
   3. ارسم بوابة باستخدام أداة الرسم البياني أحادية البوابة لتضمين الخلايا القابلة للتطبيق فقط. قم بتسمية البوابة قابلة للتطبيق.
   4. بعد ذلك ، من نافذة تخطيط العينة ، اسحب البوابة القابلة للتطبيق إلى عينات الخلية الأخرى لتطبيق البوابة بشكل موحد.
   5. في نافذة التخطيط، تصور جميع العينات كرسوم بيانية للقناة البنفسجية (قابلية للتطبيق). التحقق من أن بوابات الخلية القابلة للحياة مناسبة عبر العينات قبل المتابعة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإجراء التعديلات حسب الحاجة.
      ملاحظه: يمكن أن يظهر تلطيخ الجدوى اختلافات عبر العلاجات.
5. بوابة الخلايا القديمة.
   1. انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات الخلية القابلة للتطبيق ذات البوابات لعنصر التحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها.
   2. تصور البيانات كمخطط نقطي للقناة الحمراء البعيدة (DDAOG) مقابل القناة الخضراء (AF).
   3. ارسم بوابة باستخدام أداة بوابة المستطيل لتشمل <5٪ من الخلايا التي تكون DDAOG+ وAF+ (الربع الأيمن العلوي). قم بتسمية البوابة المبكرة.
   4. بعد ذلك ، من نافذة تخطيط العينة ، اسحب البوابة القديمة إلى المجموعات الفرعية القابلة للتطبيق لعينات الخلايا الأخرى لتطبيق البوابة بشكل موحد.
   5. في نافذة التخطيط ، قم بسحب وإسقاط جميع المجموعات الفرعية للخلايا القابلة للتطبيق المسورة في القسم 4.4. تصور جميع العينات القابلة للتطبيق على أنها حمراء بعيدة (على سبيل المثال ، APC-A) مقابل مخططات نقطية للقناة الخضراء (على سبيل المثال ، FITC-A).
   6. تأكد من أن البوابة الشائخة المرسومة في الخطوة 4.5.3 مرئية على جميع قطع الأرض وأن بوابة التحكم في السيارة فقط تظهر ≤5٪ -10٪ من الخلايا الشائخة.
6. بمجرد تحديد النسبة المئوية للخلايا العمرة باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه، قدم البيانات الناتجة باستخدام مخططات FlowJo، الملخصة في جدول البيانات، و / أو تحليلها إحصائيا باستخدام البرامج القياسية.

المواد