$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تحضير الكواشف
- وسط الأملاح الصفراوية: لتحضير مرق الصويا التريبتيك (TSB) الذي يحتوي على 0.4٪ أملاح صفراوية (الوزن / الحجم) ، أعد تعليق 200 مجم من الأملاح الصفراوية في 50 مل TSB معقمة. يتم تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنع طازجا متوسطا أسبوعيا.
تلاحظ: الأملاح الصفراوية المستخدمة بشكل روتيني عبارة عن خليط 1: 1 من كولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديوم المعزولة من مرارة الأغنام والأبقار. كما هو موضح سابقا ، كان وجود الجلوكوز مطلوبا لتكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء. أضاف TSB الجلوكوز بالنسبة إلى مرق Luria-Bertani (LB). وبالتالي ، كان كافيا للحث على تكوين الأغشية الحيوية في الشيغيلا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى التي تم تحليلها. اعتمادا على البكتيريا المراد تحليلها ، قد تكون هناك حاجة إلى تركيزات مختلفة من الجلوكوز أو متطلبات مختلفة من السكر.
- 0.5٪ وزن / حجم البنفسج الكريستالي في الماء: قم بإذابة 2.5 جم من البنفسج البلوري في 500 مل من الماء المقطر. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير البكتيريا
- قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات البكتيرية ليتم اختبارها عن طريق تلقيح 3 مل من TSB بمستعمرة واحدة معزولة جيدا في أنبوب استزراع معقم. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 225 دورة في الدقيقة للحضانة الليلية (16 - 24 ساعة).
ملاحظه: يجب إعادة السلالات من مخزون المجمد كل 2 إلى 4 أسابيع والحفاظ عليها على أطباق لا يزيد عمرها عن أسبوعين.
3. فحص الالتزام بالمرحلة الصلبة
ملاحظة: يحدد هذا الاختبار البكتيريا الملتصقة باستخدام طريقة لوحة 96 بئرا. تزرع البكتيريا بشكل ثابت في صفائح مسطحة القاع. يتم إجراء الغسيل لإزالة البكتيريا غير الملتصقة والبكتيريا الملتصقة ملطخة بالبنفسج الكريستالي. تربط البقعة البنفسجية البلورية الببتيدوغليكان في جدار الخلية البكتيرية ويمكن إذابتها باستخدام الإيثانول. يتم تحديد عدد البكتيريا الملتصقة بناء على احتباس البنفسج البلوري.
- قم بإعداد أنبوبين سعة 1.5 مل. ملصق مع TSB أو TSB + أملاح الصفراء (BS).
- أضف 1 مل من TSB أو TSB + BS إلى الأنابيب المعنية.
- تلقيح الأنابيب ب 20 ميكرولتر من المزرعة الليلية (عند تخفيف 1:50).
- في صفيحة معقمة وشفافة ومسطحة القاع ومعالجة بزراعة الأنسجة مكونة من 96 بئرا ، أضف 130 ميكرولتر / بئر من وسائط التحكم غير الملقحة إلى ثلاثة آبار لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ. قم بإعداد ثلاثة آبار تحكم لكل نوع من أنواع الوسائط (TSB و TSB + BS) لاختبارها.
- أضف 130 ميكرولتر / بئر من الثقافة الملقحة في ثلاثة آبار وكرر حتى يتم طلاء جميع الظروف التجريبية بثلاث نسخ
.
- احتضان لمدة 4 - 24 ساعة عند 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
- باستخدام قارئ لوحة ، سجل OD600. اضبط آبار التحكم على أنها "فارغة". تأكد من أن وسيط التحكم واضح مع عدم وجود دليل على التعكر. إذا تم اكتشاف أي تعكر ، فتجاهل التجربة. يمكن استخدام قيم OD600 لتطبيع البيانات إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
- قم بإزالة وسط الثقافة باستخدام خط تفريغ عن طريق إمالة اللوحة برفق وشفط الوسط ببطء عند الحافة السفلية للبئر. تأكد من جمع كل وسط الاستزراع دون تعطيل مجموعة البكتيريا الملتصقة الموجودة على السطح البلاستيكي. إذا تم إنتاج مصفوفة عديد السكاريد خارج الخلية (EPS) خلال وقت الحضانة ، تصور المصفوفة على أنها راسب أبيض. لا تزعج مصفوفة EPS.
- اغسل الآبار برفق مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). قم بإزالة غسل PBS باستخدام خط التفريغ.
- اقلب اللوحة حتى تجف. اتركه لمدة 20 دقيقة على الأقل حتى يجف.
ملاحظه: نظرا لأنه يجب تجفيف الأغشية الحيوية تماما قبل تلطيخها ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة لبضع ساعات أو حتى بين عشية وضحاها. لن يغير وقت التجفيف الإضافي إجراء التلوين بينما سيؤثر التجفيف غير المكتمل على القياس الكمي للنتائج وقابلية التكرار.
- أضف 150 ميكرولتر من البنفسج البلوري 0.5٪ إلى كل تجربة وتحكم جيدا.
- احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- اغسل الآبار مرة واحدة ب 400 ميكرولتر من الماء المقطر. يساعد الحجم الإضافي على إزالة بقعة البنفسج الكريستالية المتبقية من جوانب الآبار. قم بإزالة الغسيل بخط التفريغ.
- اغسل الآبار خمس مرات ب 200 ميكرولتر من الماء المقطر. قم بإزالة الغسيل بخط التفريغ.
ملاحظه: الغسيل الشامل مهم للقياس الكمي. عندما تكون الآبار الفارغة خالية من الماء المقطر ولا تحتوي على أي بقعة بنفسجية بلورية متبقية ، انتقل إلى الخطوة التالية.
- اقلب اللوحة حتى تجف ، محمية من الضوء. تأكد من التجفيف الكامل للوحة كما هو مذكور أعلاه.
- تخلص من الآبار ب 200 ميكرولتر من 95٪ إيثانول. احتضن الطبق على الخلاط لمدة 30 دقيقة. لتجنب التبخر ، خاصة في درجات الحرارة المرتفعة ، قم بتنفيذ هذه الخطوة عند 4 درجات مئوية.
- باستخدام قارئ اللوحة ، سجل الكثافة البصرية عند 540 (OD540).
ملاحظه: الطول الموجي لأقصى امتصاص للبنفسج البلوري قريب من 590 نانومتر. تشير الأدبيات إلى نطاق من OD540 - OD595 لامتصاص البنفسجي البلوري. وبالتالي اختر الطول الموجي المتاح بناء على قارئ اللوحة.