اختبار لدراسة تكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء من خلال اكتشاف مصفوفة EPS

الملخص

المصدر: Nickerson، K.P.، et al. تكوين الأغشية الحيوية الناجمة عن ملح الصفراء في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات التحديد والقياس الكمي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة قائمة على التألق لتحديد تكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء. عند إضافة أملاح الصفراء في ثقافة البكتيريا المعوية المسببة للأمراض ، يتم الكشف عن إنتاج الأغشية الحيوية باستخدام ليكتين الفلورسنت الذي يرتبط بالسكريات في مصفوفة المادة البوليمرية خارج الخلية (EPS) للأغشية الحيوية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف

1. الأملاح الصفراوية المتوسطة (BS): لتحضير مرق الصويا التريبتيك (TSB) الذي يحتوي على 0.4٪ أملاح صفراوية (الوزن / الحجم) ، أعد تعليق 200 مجم من الأملاح الصفراوية في 50 مل TSB معقمة. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنع متوسطا طازجا أسبوعيا.
   تلاحظ: الأملاح الصفراوية المستخدمة بشكل روتيني عبارة عن خليط 1: 1 من كولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديوم المعزولة من مرارة الأغنام والأبقار. كما هو موضح سابقا ، كان وجود الجلوكوز مطلوبا لتكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء. أضاف TSB الجلوكوز بالنسبة إلى مرق Luria-Bertani (LB). وبالتالي ، كان كافيا للحث على تكوين الأغشية الحيوية في الشيغيلا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى التي تم تحليلها. اعتمادا على البكتيريا المراد تحليلها ، قد تكون هناك حاجة إلى تركيزات مختلفة من الجلوكوز أو متطلبات مختلفة من السكر.
2. 0.5٪ وزن / حجم البنفسج الكريستالي في الماء: قم بإذابة 2.5 جم من البنفسج البلوري في 500 مل من الماء المقطر. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
3. Concanavalin A (ConA) مترافق مع فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC): أعد تكوين المخزون في 1x PBS. قم بتخفيف المخزون المركز 10 مجم ب 400 ميكرولتر من 1x PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 25 ميكروغرام / مل ، واحميته من الضوء.
4. PBS + الجلوكوز: قم بإذابة 0.2 جم من الجلوكوز في 10 مل 1x PBS (2٪ وزن / حجم الجلوكوز النهائي). تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنعها طازجة في يوم الاستخدام.
5. PBS + الأملاح الصفراوية: قم بإذابة 40 مجم في 10 مل 1x PBS (0.4٪ وزن / حجم أملاح صفراوية نهائية). تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنعها طازجة في يوم الاستخدام.
6. PBS + الجلوكوز والأملاح الصفراوية: قم بإذابة 40 مجم من الأملاح الصفراوية و 0.2 جم جلوكوز في 10 مل 1x PBS (0.4٪ وزن / حجم أملاح الصفراء و 2٪ وزن / حجم الجلوكوز النهائي). تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنعها طازجة في يوم الاستخدام.
7. تحضير لوحات أجار LB.
8. إصلاح الفورمالديهايد / الجلوتارالديهايد: أضف 810 ميكرولتر من الفورمالديهايد (محلول مخزون 37٪ ، تركيز نهائي 3٪) و 125 ميكرولتر من الجلوتارالديهايد (محلول مخزون 25٪ ، تركيز نهائي 0.25٪) إلى 14 مل 1x PBS. تخلط جيدا وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يجب أن يكون الإصلاح باردا للاستخدام السليم.
   أنذر: الإصلاح سام ويتطلب التخلص من النفايات الخطرة.
9. محلول مثبت مضاد للبهتان: استخدم محلول مثبت مضاد للبهتان يحتوي على صبغة 4،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمنع التبييض الضوئي لعينات الفحص المجهري المناعي الفلوري أثناء تلطيخ الحمض النووي للبكتيريا بالفلورسنت.

< p class = "jove_title" >2. تحضير البكتيريا

1. قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات البكتيرية ليتم اختبارها عن طريق تلقيح 3 مل من TSB بمستعمرة واحدة معزولة جيدا في أنبوب استزراع معقم. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة للحضانة الليلية (16 - 24 ساعة).
   ملاحظه: يجب إعادة السلالات من مخزون المجمد كل 2 إلى 4 أسابيع ، والحفاظ عليها على أطباق لا يزيد عمرها عن أسبوعين.

3. EPS كشف المصفوفة

ملاحظة: تحدد هذه المقايسات التكميلية EPS وتصورها. في كليهما ، يتم الكشف عن EPS باستخدام الليكتين لربط السكريات. يسمح البروتين المترافق بالفلورسنت بالقياس الكمي.

1. الكشف شبه الكمي عن EPS
   1. قم بإعداد أنبوبين سعة 1.5 مل. الملصق مع TSB أو TSB + BS.
   2. أضف 1 مل من TSB أو TSB + BS إلى الأنابيب المعنية.
   3. تلقيح الأنابيب ب 20 ميكرولتر من المزرعة الليلية (تخفيف 1:50).
   4. في صفيحة معقمة ، سوداء ، مسطحة القاع ، معالجة بزراعة الأنسجة ، أضف 130 ميكرولتر / بئر من وسائط التحكم غير الملقحة إلى ثلاثة آبار لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ. قم بإعداد ثلاثة آبار تحكم لكل نوع متوسط يتم اختباره. أضف 130 ميكرولتر / بئر من المزرعة الملقحة إلى الآبار ، وكرر العملية حتى يتم طلاء جميع الظروف التجريبية بثلاث نسخ.
   5. احتضان لمدة 4 - 24 ساعة عند 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
   6. انقل وسط الاستزراع إلى صفيحة شفافة سعة 96 بئرا باستخدام ماصة، وهي ماصة متعددة القنوات بشكل مثالي. كن حذرا لجمع كل وسيط الاستزراع دون تعطيل السكان الملتزمين و / أو EPS الموجود على السطح البلاستيكي. جانبا.
   7. قم بتثبيت الصفيحة السوداء لمدة 15 دقيقة في RT باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من الفورمالديهايد / الجلوتارالديهايد في 1x PBS.
   8. أثناء تثبيت السكان الملتصقين ، قم بتقييم الكسر الطافي من الخطوة 1.1.6. باستخدام قارئ لوحة ، سجل OD_600. اضبط آبار التحكم على أنها "فارغة". تأكد من أن وسيط التحكم واضح مع عدم وجود دليل على التعكر. إذا تم اكتشاف أي تعكر ، فتجاهل التجربة.
      1. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء الفحص بالكامل في لوحة سفلية سوداء شفافة. وفي هذه الظروف، يمكن تسجيل قيم OD₆₀₀ ويمكن التخلص من وسط الاستزراع لاحقا قبل الانتقال إلى الخطوة 7.1.3. يمكن استخدام قيم OD₆₀₀ لتطبيع البيانات في حالة وجود اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
   9. قم بإزالة الإصلاح والتخلص من النفايات الخطرة.
   10. اغسل الآبار برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS المعقم. قم بإزالة غسل PBS باستخدام خط التفريغ عن طريق إمالة اللوحة برفق وشفط الغسيل ببطء عند الحافة السفلية للبئر.
   11. أضف 150 ميكرولتر / بئر من 25 ميكروغرام / مل ConA-FITC ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في RT.
   12. يغسل برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS.
   13. أضف 150 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر. سجل التألق عند 488 نانومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرق الصويا Tryptic سيجما ألدريتش 22092-500 جرام كونكانافالين - إيه فيتسي سيغما سي 7642-10 ملغ الجلوكوز سيغما G7021-1KG أملاح صفراوية سيغما ب 8756-100 جرام إل بي أجار سيغما L7533-1 كجم أنابيب استزراع 14 مل ، 17 × 100 مم ، بلاستيك ، معقمة صياد 14-959-11 ب Vectashield المضاد للبهتان الصلب مع DAPI مختبرات ناقلات إتش-1500 فورمالدهيد سيجما ألدريتش F1635-500 الجلوترالديهايد سيجما ألدريتش جي 6257 ألواح مسطحة القاع 96 بئرا (شفافة) برنامج النقاط التجارية 92696 ألواح مسطحة القاع 96 بئرا (أسود) غرينر بيو ون 655076 ألواح مسطحة القاع 24 بئرا (شفافة) برنامج النقاط التجارية 92424 قارئ لوحة 96 جيدا سبكتراماكس قارئ لوحة فلورسنت بيوتيك سينرجي 2 مجهر متحد البؤر أو الفلورسنت مجهر متحد البؤر A1 من نيكون 37 °C حاضنة اهتزاز نيو برونزويك ساینتفيك إكسيلا E25 37 °C حاضنة لوحة سلسلة Thermolyne 5000