الكشف عن تفكيك الأغشية الحيوية من خلال فحص التشتت

الملخص

المصدر: Nickerson، K.P. et al.، تكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات التحديد والقياس الكمي.J. Vis. Exp.(2018)

يعرض الفيديو مقايسة تشتت الأغشية الحيوية باستخدام لوحة متعددة الآبار. تعمل المعالجة العازلة والجلوكوز على تفكيك الأغشية الحيوية ، وتطلق البكتيريا ، بينما تحفز الأملاح الصفراوية الإجهاد ، وتحتفظ بالبكتيريا في المادة البوليمرية الواقية خارج الخلية. يؤكد التشتت العالي مع المخزن المؤقت والجلوكوز التفكيك الناجح للأغشية الحيوية ، والذي تم تقديره من خلال قياس وحدات تشكيل المستعمرة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف

1. وسط الأملاح الصفراوية: لتحضير مرق الصويا التريبتيك (TSB) الذي يحتوي على 0.4٪ أملاح صفراوية (الوزن / الحجم) ، أعد تعليق 200 مجم من الأملاح الصفراوية في 50 مل TSB معقمة. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنع متوسطا طازجا أسبوعيا.
   تلاحظ: الأملاح الصفراوية المستخدمة بشكل روتيني عبارة عن خليط 1: 1 من كولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديوم المعزولة من مرارة الأغنام والأبقار. كما هو موضح سابقا ، كان وجود الجلوكوز مطلوبا لتكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء. أضاف TSB الجلوكوز بالنسبة إلى مرق Luria-Bertani (LB). وبالتالي ، كان كافيا للحث على تكوين الأغشية الحيوية في الشيغيلا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى التي تم تحليلها. اعتمادا على البكتيريا المراد تحليلها ، قد تكون هناك حاجة إلى تركيزات مختلفة من الجلوكوز أو متطلبات مختلفة من السكر.
2. 0.5٪ وزن / حجم البنفسج الكريستالي في الماء: قم بإذابة 2.5 جم من البنفسج البلوري في 500 مل من الماء المقطر. يتم تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
3. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) + الجلوكوز: قم بإذابة 0.2 جم من الجلوكوز في 10 مل 1x PBS (2٪ وزن / حجم جلوكوز نهائي). يتم تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنعها طازجة في يوم الاستخدام.
4. PBS + الأملاح الصفراوية: قم بإذابة 40 مجم في 10 مل 1x PBS (0.4٪ وزن / حجم أملاح صفراوية نهائية). تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنعها طازجة في يوم الاستخدام.
5. PBS + الجلوكوز والأملاح الصفراوية: قم بإذابة 40 مجم من الأملاح الصفراوية و 0.2 جم جلوكوز في 10 مل 1x PBS (0.4٪ وزن / حجم أملاح الصفراء و 2٪ وزن / حجم الجلوكوز النهائي). يتم تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنعها طازجة في يوم الاستخدام.
6. تحضير لوحات أجار LB.

< p class = "jove_title" >2. تحضير البكتيريا

1. قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات البكتيرية ليتم اختبارها عن طريق تلقيح 3 مل من TSB بمستعمرة واحدة معزولة جيدا في أنبوب استزراع معقم. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 225 دورة في الدقيقة للحضانة الليلية (16 - 24 ساعة).
   ملاحظه: يجب إعادة إخراج السلالات من مخزون المجمد كل 2 إلى 4 أسابيع والحفاظ عليها على أطباق لا يزيد عمرها عن أسبوعين.

< p class = "jove_title" >3. فحص التشتت

ملاحظة: في هذا الفحص ، يتم الكشف عن تفكيك الأغشية الحيوية من خلال التشتت البكتيري. هنا ، يتم إنشاء الأغشية الحيوية الناضجة وبعد ذلك (عادة في اليوم التالي) ، يتم استبدال الوسائط ب PBS أو PBS التكميلية. ثم يتم تقييم المكون الطافي لتحديد عدد البكتيريا التي انفصلت عن الأغشية الحيوية.

1. قم بإعداد أنبوبين سعة 1.5 مل. الملصق مع TSB أو TSB + BS (أملاح الصفراء).
2. أضف 1 مل من TSB أو TSB + BS إلى الأنابيب المعنية.
3. تلقيح الأنابيب ب 20 ميكرولتر من المزرعة الليلية (عند تخفيف 1:50).
4. في صفيحة معقمة وشفافة ومسطحة القاع ومعالجة بزراعة الأنسجة مكونة من 96 بئرا ، أضف 130 ميكرولتر / بئر من وسائط التحكم غير الملقحة إلى ثلاثة آبار لتكون بمثابة عنصر تحكم فارغ. قم بإعداد ثلاثة آبار تحكم لكل نوع وسائط ليتم اختباره.
5. أضف 130 ميكرولتر / بئر من المزرعة الملقحة إلى ثلاثة آبار وكرر ذلك حتى يتم طلاء جميع الظروف التجريبية بثلاث نسخ.
6. احتضان اللوحة لمدة 4 - 24 ساعة عند 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
7. قبل المتابعة ، قم بتسخين PBS و PBS + الجلوكوز و PBS + الأملاح الصفراوية و PBS + الأملاح الصفراوية + الجلوكوز إلى 37 درجة مئوية.
8. باستخدام قارئ اللوحة ، سجل الكثافة البصرية ، OD₆₀₀. اضبط آبار التحكم على أنها "فارغة". تأكد من أن الوسط واضح مع عدم وجود دليل على التعكر. إذا تم اكتشاف أي تعكر ، فتجاهل التجربة. يمكن استخدام قيم OD₆₀₀ لتطبيع البيانات إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
9. قم بإزالة وسط الثقافة باستخدام خط تفريغ. تأكد من جمع كل وسيط الثقافة دون تعطيل السكان الملتصقين الموجودين على السطح البلاستيكي.
10. اغسل الآبار برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS المعقم. قم بإزالة غسل PBS باستخدام خط التفريغ.
11. استبدل الغسيل ب 130 ميكرولتر / بئر مما يلي في ثلاثة آبار لكل منها: PBS و PBS + جلوكوز و PBS + أملاح الصفراء و PBS + أملاح الصفراء + الجلوكوز. يجب تسخين هذه الكواشف مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
12. احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
13. قم بإزالة اللوحة بعناية من الحاضنة 37 درجة مئوية. انقل المواد الطافية إلى طبق طازج ومعقم مكون من 96 بئرا.
14. باستخدام صفيحة 96 بئرا أو كتلة تخفيف ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف (1:10) للمادة الطافية إلى PBS معقمة. < / > ملاحظه: يجب أن تتراوح سلسلة التخفيف من غير المخفف إلى ^10-6 اعتمادا على السلالة البكتيرية المراد اختبارها. يمكن إجراء تجارب تجريبية لتحديد نطاق التخفيف الأمثل.
15. ضع صفيحة موضعية 5 ميكرولتر من كل تخفيف على LB أجار باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل. عد المستعمرات في اليوم التالي وحساب عامل التخفيف عند تحديد وحدات تشكيل مستعمرة الاسترداد (CFU). لحساب النسبة المئوية للتشتت بالنسبة لعنصر تحكم 1x PBS (تم تعيينه عند 100٪) ، اقسم CFU الاسترداد من كل حالة معالجة على CFU الاسترداد من عينة التحكم 1x PBS.
    ملاحظه: يمكن أيضا استخدام لوحات الوسائط الروتينية للسلالة البكتيرية ذات الأهمية. على سبيل المثال ، يمكن طلاء الشيغيلا على ألواح الكونغو الحمراء. تأكد من جفاف الألواح لتقنيات الطلاء الموضعية المناسبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرق الصويا Tryptic سيجما ألدريتش 22092-500 جرام الجلوكوز سيغما G7021-1KG أملاح صفراوية سيغما ب 8756-100 جرام إل بي أجار سيغما L7533-1 كجم أنابيب استزراع 14 مل ، 17 × 100 مم ، بلاستيك ، معقمة صياد 14-959-11 ب ألواح مسطحة القاع 96 بئرا (شفافة) برنامج النقاط التجارية 92696 قارئ لوحة 96 جيدا سبكتراماكس قارئ لوحة فلورسنت بيوتيك سينرجي 2 37 °C حاضنة اهتزاز نيو برونزويك ساینتفيك إكسيلا E25 37 °C حاضنة لوحة سلسلة Thermolyne 5000