$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تحضير غشاء حيوي في المختبر للبكتيريا في المستعمرة الفطرية
- الطرد المركزي للثقافة البكتيرية عند 5,000 × جم لمدة 3 دقائق وتعليق الحبيبات في 25 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 M (25 جم / لتر KH2PO4 و 2.78 جم / لتر K2HPO4 ، درجة الحموضة 5.8). كرر هذه الخطوة مرة واحدة واضبط التركيز البكتيري النهائي على 109 خلايا / مل بنفس المخزن المؤقت.
- املأ صفيحة دقيقة مكونة من 6 آبار ب 5 مل من المعلق البكتيري (أو عازلة معقمة 0.1 متر من فوسفات البوتاسيوم للتحكم السلبي).
- قطع غشاء السيلوفان للثقافة الفطرية بشفرة حلاقة معقمة للحصول على مربعات من السيلوفان مع مستعمرة فطرية واحدة على كل غشاء. قم بإزالة مربعات السيلوفان التي تحتوي على خيوط بعناية من الوسط الصلب باستخدام ملقط وانقل مربع السيلوفان المحتوي على خيوط إلى بئر الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على المعلق البكتيري.
- رج الصفيحة الدقيقة برفق بينما لا تزال المستعمرات الفطرية متصلة بالسيلوفان ؛ ثم قم بإزالة صفائح السيلوفان ، مع ترك المستعمرات الفطرية في اللوحة.
- احتضان الصفيحة الدقيقة بتحريض لطيف (~ 60 دورة في الدقيقة) عند درجة حرارة تتكيف مع الكائنات الحية الدقيقة المدروسة.
ملاحظه: يعتمد وقت الحضانة على سرعة إنشاء الأغشية الحيوية والمرحلة المراد تحليلها. بالنسبة إلى P. fluorescens BBc6 / L. ثنائي اللون ، احتضن عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للحصول على أغشية حيوية في المرحلة المبكرة وما يصل إلى 16 ساعة للحصول على أغشية حيوية ناضجة.
فئة
2. تحليل المجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر لتكوين الأغشية الحيوية
- تحضير العينة
- لإزالة بكتيريا العوالق والبكتيريا المرتبطة إلكتروستاتيكيا بالخيوط ، اشطف الفطريات عن طريق نقلها إلى صفيحة دقيقة جديدة مكونة من 6 آبار مملوءة ب 5 مل من محلول ملح قوي (كلوريد الصوديوم ، 17 جم / لتر) ؛ رجها برفق لمدة 1 دقيقة.
- انقل الفطريات إلى صفيحة دقيقة جديدة مكونة من 6 آبار تحتوي على 5 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 متر ، ورجه برفق لمدة دقيقتين ، ثم انقل الفطريات إلى محلول فوسفات البوتاسيوم الطازج.
- قم بقص جزء المستعمرة الفطرية المراد تصويره بمشرط مع الاحتفاظ به في مخزن فوسفات البوتاسيوم ، بحيث يحتوي القسم الذي تم الحصول عليه على حوالي نصف المستعمرة الفطرية.
- لتلطيخ العينة ، انقلها إلى طبق بتري مملوء بالماء المعقم الذي يحتوي على صبغة فلورية مناسبة (حسب الهدف من التحليل) ، واحتضانها في الظلام.
- لتصور الشبكة الفطرية ، استخدم ، على سبيل المثال ، الكونغو الأحمر (تركيز نهائي 0.1٪ ، 5 دقائق من الحضانة) ، أو ليكتين جنين القمح (WGA) المقترن ب Alexa Fluor 633 (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل ، 10 دقائق من الحضانة) أو FUN1 (تركيز نهائي 10 ميكرومتر ، 10 دقائق من الحضانة).
- إذا كنت تستخدم بكتيريا غير ذات علامات فلورية ، فقم بتلطيخ الخلايا البكتيرية بمسبار فلوري خاص بالحمض النووي من بين العديد من أصباغ الحمض النووي الدائمة للخلايا المتوفرة تجاريا. على سبيل المثال ، استخدم DAPI (تركيز نهائي 0.25 ميكروغرام / مل ، 10 دقائق من الحضانة).
- لتصور بروتينات المصفوفة ، استخدم صبغة البروتين.
- بعد التلوين ، اشطف العينة عن طريق نقلها إلى غطاء طبق بتري يحتوي على 10 مل من فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 متر ورجها برفق لمدة 1 دقيقة.
- اغمر نصف شريحة في غطاء طبق بتري واجعل القسم المقطوع يطفو بدقة فوق الشريحة. بعد ذلك ، قم بإزالة الشريحة ببطء من محلول المخزن المؤقت ، مما يسمح للعينة بالاستقرار برفق على الشريحة.
ملاحظه: في هذه الخطوة ، من المهم جدا المضي قدما برفق لتجنب اضطراب الأغشية الحيوية.
- أخيرا ، أضف 10 ميكرولتر من وسيط التثبيت المضاد للبهتان إلى العينة وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.
ملاحظه: بمجرد تحضير الشريحة ، يجب إجراء التحليل المجهري في أسرع وقت ممكن (في غضون 30 دقيقة على الأقصاية) لتجنب التعديل في بنية الأغشية الحيوية.