تحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا التائية المقيمة في مناطق الورم المختلفة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

الملخص

المصدر: Peranzoni, Elisa, et al. تصوير Ex vivo للخلايا الليمفاوية CD8 T المقيمة في شرائح ورم الرئة البشرية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو تصوير خلايا CD8 T المقيمة المتسللة للورم والتي تم تصنيفها بأجسام مضادة مقترنة بالفلورسنت داخل شرائح ورم الرئة البشرية. تسمح هذه التقنية بإجراء تحليلات في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا التائية CD8 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التلوين المناعي للخلايا التائية CD8 المقيمة والخلايا السرطانية

1. تمييع الأجسام المضادة (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل) والصبغة النووية (التركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل) في وسائط RPMI-1640 بدون الفينول الأحمر.
   ملاحظه: استخدم الأجسام المضادة المضادة ل CD8 المقترنة بالفلورسنت (الفئران IgG ، استنساخ SK1) والأجسام المضادة ل EpCAM (جزيء التصاق الخلايا الظهارية) (الفئران IgG HEA-125) لتسمية الخلايا الليمفاوية CD8 T والخلايا الظهارية للورم ، على التوالي. استخدم الجسم المضاد المضاد ل CD90 / Thy1 المقترن بالفلورسنت (الفئران IgG ، استنساخ 5E10) لتسمية الخلايا الليفية والخلايا البطانية المنشطة. استخدم 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتسمية نواة الخلايا بغشاء بلازما مخترق من أجل تقييم صلاحية الأنسجة.
2. قم بإزالة ألواح الاستزراع من الحاضنة واستخدم ماصة لشفط أي سائل داخل غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ. لا تقم بإزالة وسائط RPMI-1640 سعة 1.1 مل الموضوعة تحت إدخالات زراعة الخلايا.
3. دون لمس الشريحة واستخدام طرف الماصة، أضف 40 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة على كل شريحة من الورم.
4. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بتلوين الأجسام المضادة.
5. باستخدام ملقط ناعم ، قم بإزالة الغسالات ، وأخرج الشرائح ، واغمسها 10 ثوان في وسائط RPMI-1640 بدون أحمر الفينول. ضع الشرائح مرة أخرى على إدخالات زراعة الخلايا وأضف قطرة من وسط RPMI-1640 الخالي من الفينول على كل شريحة على حدة. حافظ على اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. انتقل إلى التصوير.

فئة

2. تصوير وتحليل هجرة الخلايا التائية CD8 المقيمة داخل شرائح ورم الرئة البشرية

ملاحظة: المجهر متحد البؤر المستخدم في هذا البروتوكول هو قرص دوار عمودي مزود بهدف غمر الماء 25x (25x / 0.95 NA).

1. إعداد إعداد المجهر
   1. اضبط درجة حرارة غرفة تسخين المجهر على 37 درجة مئوية قبل ساعات قليلة من بدء جلسة التصوير.
   2. قم بإعداد نظام لنشر شرائح الورم باستمرار بوسط RPMI خال من الفينول بالأكسجين (5٪ CO₂ ، 95٪ O₂) (الشكل 1). استخدم مضخة تمعجية لتدفق وسائط التروية إلى غرفة التصوير وشفط المحلول إلى قارورة جمع النفايات.
   3. قم بتشغيل المضخة التمعجية للسماح للمحلول المؤكسج بالمرور عبر أنابيب التروية.
2. باستخدام ملقط ناعم ، أخرج الشريحة من اللوحة المكونة من 6 آبار وانقلها إلى طبق بلاستيكي مقاس 35 مم مملوء بوسط RPMI خال من الفينول باللون الأحمر. قم بتثبيت الشريحة بمرساة شريحة قطرها 19.7 مم بخيوط متباعدة 2 مم. ضع طبق بتري في مرحلة التصوير بالمجهر. قم بتوصيل أطراف المدخل والمخرج لنظام التروية. قم بتشغيل نظام التروية واضبط معدل تدفق الوسائط على 0.8 مل / دقيقة.
3. اخفض هدف الغمر في الماء إلى الشريحة. ركز على الجزء العلوي من الشريحة بضوء المجال الساطع. باستخدام ضوء الفلورسنت المناسب ، حدد منطقة ذات أهمية تحتوي على خلايا CD8 T ، وجزر الورم (إيجابية ل EpCAM) ، ومنطقة السدى (إيجابية ل CD90). تحقق من صلاحية الخلايا داخل الشريحة من خلال تقييم تلطيخ DAPI على السطح المقطوع وأعمق في الأنسجة.
   ملاحظة: تحتوي الشريحة السليمة على أقلية فقط من الخلايا الإيجابية ل DAPI على عدة ميكرون من السطح المقطوع.
4. قم بتعيين جلسة تصوير بالإجراءات التالية.
   1. اعتمادا على شدة إشارة الفلورسنت ل 3 فلوروفورات ، اضبط وقت التعرض بين 50 إلى 800 مللي ثانية وشدة الليزر بين 20 إلى 40٪.
   2. حدد سمك المكدس z للتصوير داخل شريحة الورم.
      ملاحظه: هنا ، تم التقاط 10-12 طائرة بصرية تمتد على عمق إجمالي يتراوح بين 60 و 70 ميكرومتر في البعد z.
   3. حدد موضع البدء عند حوالي 10 ميكرومتر أسفل خلايا CD8 T الأولى المسماة.
   4. حدد الفاصل الزمني بين كل صورة z-stack بين 10 إلى 30 ثانية وإجمالي وقت التسجيل بين 10 إلى 30 دقيقة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: صور لنظام التروية. أ) يتم إثراء محلول RPMI الخالي من الفينول باللون الأحمر بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 95٪ O₂. ب) ثم يتم ترشيح المحلول بواسطة مضخة تمعجية. ج) يدخل حل RPMI إلى طبق الثقافة عبر المدخل. عند المخرج ، يتم شفط المحلول بواسطة المضخة من الغرفة إلى حاوية نفايات. لاحظ أن طرف الشفط مضبوطة على مستوى لتحديد ارتفاع المحلول.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجهر متحد البؤر المستقيم لايكا يوصى باستخدام قرص دوار متحد البؤر برنامج Imaris Bitplane يستخدم هذا البرنامج لتصور الصور وتتبع ترحيل الخلايا التائية ملقط ناعم أدوات الدقة العالمية 14142 [إ] إدخالات ثقافة 30 مم ميليبور PICM0RG50 معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المتوسط, مكمل GlutaMAX ثيرموفيشر 61870010 يتم تصنيع متوسط RPMI الكامل عن طريق إضافة مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة بنسبة 10٪ والبنسلين / الستربتومايسين محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر 20012019 محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) إنفيتروجين 14170088 درجة حرارة تبلور منخفضة Agarose ، النوع VII-A سيجما ألدريتش أ 0701 غير سامة بوتيل Cyanoacrylate الغراء ، Vetbond 3 م 1469 مثبتات الشرائح ، قطر 19.7 ، خيوط متباعدة 2 مم وارنر إنسترومنتس 64-1415 غسالات من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 5 مم من القطر الداخلي الامازون B004K1FDGQ مضاد CD8 مترافق BV605 (استنساخ SK1) BD Biosciences 565289 مضاد EpCAM المترافق FITC (استنساخ HEA-125) ميلتيني بيوتيك 130-098-113 مضاد CD90 مترافق BV510 (استنساخ 5E10) بيوليجند 328125 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI ثيرموفيشر د1306