تقنية قياس التدفق الخلوي FRET للكشف عن تراكم بروتين المراسل المستحث ببذور تاو

الملخص

المصدر: Furman ، J. L. ، et al. الكشف الحساس عن نشاط البذر البروتيوباثي باستخدام قياس التدفق الخلوي FRET. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح الفيديو مقايسة التدفق الخلوي لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) للكشف عن نشاط البذر لمجاميع البروتين المعزولة من العينات البيولوجية. يتم تحضين خلايا الثدييات التي تعبر عن بروتينات مراسل تاو بمجمعات نقل الجسيمات الشحمية التي تحتوي على بذور تاو. تتوسط هذه البذور في تجميع بروتينات المراسل ، مما يؤدي إلى توليد إشارة موجبة FRET في مقياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

ملاحظة: يؤكد هذا البروتوكول على استخدام قياس التدفق الخلوي FRET للكشف عن نشاط البذر من العينات البيولوجية للفئران. كما أنه متوافق مع الألياف المؤتلفة والعينات البيولوجية البشرية. تم إجراء القتل الرحيم للفأر وحصاد الدماغ وفقا للإجراءات المعتمدة من IACUC.

< ص الفئة = "jove_title" >1. استخراج الدماغ

1. بعد التخدير العميق بالأيزوفلوران (2٪) ، قم ببث فأر يحتوي على PBS مثلج يحتوي على 0.03٪ هيبارين ، واستخرج الدماغ باتباع التفاصيل الموضحة في Gage et al.
2. ضع الأنسجة المستخرجة في قارورة التبريد ، وقم بتجميدها عن طريق وضعها في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك ، قم بتجميد الأنسجة على الثلج الجاف. بمجرد التجميد ، انقل الأنسجة إلى -80 درجة مئوية وخزنها لفترة طويلة من الزمن ، إذا لزم الأمر.
   ملاحظه: هذا البروتوكول متوافق مع متجانسات الدماغ بالكامل أو مناطق الدماغ التشريح الدقيقة. انظر Hagihara et al.للحصول على بروتوكول تشريح دقيق مفصل.

< p class = "jove_title" >2. تحضير مادة البذور البيولوجية

1. تحضير مخزن التجانس عن طريق إذابة مثبطات الإنزيم البروتيني (خال من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)) في 1x TBS (محلول ملحي مخزن ب Tris، قرص واحد لكل 10 مل). دوامة بقوة ، وتخزينها على الجليد. يجب أن تكون مثبطات الإنزيم البروتيني خالية من EDTA من أجل الحفاظ على صلاحية خلايا المستشعر الحيوي.
2. قم بوزن أنسجة المخ المجمدة في قارب وزن يمكن التخلص منه ، وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 5 مل. أضف مخزن التجانس المثلج البارد بحيث يكون المحلول النهائي 10٪ من الوزن / الحجم. تخزينها مؤقتا على الثلج. ستختلف كتلة الأنسجة وحجم المخزن المؤقت للتجانس اللاحق اعتمادا على حجم الدماغ و / أو المناطق المستخدمة. هنا ، يتم تعليق نصف دماغ الفأر البالغ الذي يزن 0.2 غرام في 2 مل للحصول على محلول 10٪ مع حجم الحجم.
3. انقل العينات إلى غرفة باردة ، واضبط مسبار صوتي على الإعدادات المناسبة. للصوتنة المسبار مع Omni Ruptor (كما هو موضح هنا) ، اضبط الطاقة على 20٪ ، وهو ما يتوافق مع حوالي 75 واط. استخدم وضع النبض لضمان عدم تسخين العينات أثناء الصوتنة. اضبط النبض على 30٪ ، أي ما يعادل 500 مللي ثانية تقريبا.
4. قم بتنظيف طرف جهاز صوتي المسبار عن طريق الشطف بالماء والأيزوبروبانول والماء مرة أخرى ، ومسح المسبار بين كل محلول. تأكد من شطف ومسح جانبي وأسفل المسبار بمناديل المختبر.
5. العمل مع عينة واحدة في كل مرة ، اغمر طرف المسبار في المخزن المؤقت للتجانس ، وابدأ تشغيل الصوت. باستخدام إعدادات الطاقة والنبض الموضحة أعلاه ، قم بتسليم 25 نبضة إجمالية. تأكد من أن الأنسجة معلقة تماما. احرص على تجنب رغوة العينة خلال هذه الخطوة.
   ملاحظه: تكون العينات عرضة للرغوة إذا أ) الحجم الكلي منخفض أو ب) يسخن المتجانس. مع هذه الأداة المحددة ، لا تفعل صوتنة بأحجام أقل من 250 ميكرولتر. لضمان بقاء العينات باردة ، يمكن تخزين الأنابيب على الجليد خلال هذه الخطوة.
6. نظف المسبار عن طريق مسح المحللات المتبقية ، ثم قم بتوصيل 10 نبضات في دورق من الماء النظيف. اشطف جوانب وأسفل المسبار بالماء والأيزوبروبانول والماء مرة أخرى (كما في الخطوة 2.4) ، وامسحه حتى يجف بين كل خطوة. لتجنب التلوث ، اشطف المسبار جيدا بين العينات.
   ملاحظه: مع مجاميع تاو ، لم نجد أن طرق التنظيف الأكثر صرامة ضرورية لمنع التلوث من عينة إلى عينة. ومع ذلك ، قد تتطلب الأميلويدات الأخرى عناية إضافية تم وصفها على نطاق واسع في الأدبيات.
7. قم بتخزين المتجانسات على الثلج حتى تتم معالجة جميع العينات.
8. يتجانس الدوران عند 21,300 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
9. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. تخلص من الحبيبات. Aliquot من المادة الطافية ، وتخزين المحللات عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. تجنب دورات التجميد / الذوبان في المتجانسات ، لأن هذا يقلل من كفاءة البذر.

< p class = "jove_title" >3. إعادة طلاء خلايا المستشعر الحيوي

ملاحظة: استخدم أربعة خطوط خلوية لهذا الفحص: HEK 293T (خط الخلية # 1) ، RD-P301S-CFP (خط الخلية # 2) ، RD-P301S-YFP (خط الخلية # 3) ، و RD-P301S-CFP / YFP (خط الخلية # 4). يرجى الاطلاع على الجدول المرجعي 1 لمساهمة كل سطر خلية في الفحص.

1. في بيئة معقمة ، وسط ثقافة الشفط. اشطف الخلايا بمحلول ملحي دافئ مخزن بالفوسفات (PBS) ، وشفطه. قم بإخماد الخلايا (3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪)) لمدة 3 دقائق ، وقم بإخمادها بوسط مزرعة دافئة (9 مل من DMEM ، 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 1٪ جلوتا ماكس) ، ونقل الخلايا على الفور إلى أنبوب مخروطي.
2. خلايا الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في RT. وسط الشفط ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط الزراعة الدافئة.
3. باستخدام مقياس كثافة الدم ، حدد كثافة الخلية لكل خط خلية. ستختلف كثافة الخلايا اعتمادا على التقاء وقت الحصاد وحجم إعادة التعليق. أعد تعليق الخلايا التي تم حصادها من طبق 10 سم عند التقاء 90٪ في وسائط 10 مل ، لتكون كثافة الخلية حوالي 1 مليون خلية / مل.
4. قم بعمل مزيج رئيسي من الخلايا + الوسائط بحيث تحتوي كل بئر من صفيحة 96 بئر على 35,000 خلية في وسائط 130 ميكرولتر (على سبيل المثال ، لعمل مزيج رئيسي ل 100 بئر ، أعد تعليق 3.5 مليون خلية في وسائط 13 مل). قم بتعديل رقم الخلية ليناسب التصميمات التجريبية الفردية والجداول الزمنية. لمعالجة الخلايا ~ 18 ساعة بعد الطلاء ، أضف 35,000 خلية إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا.
5. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم ببسط 130 ميكرولتر من معلق الخلايا المختلطة الرئيسية ببطء في كل بئر من صفيحة 96 بئر ذات قاع مسطح ومعالج بزراعة الأنسجة. أثناء الطلاء ، ضع طرف الماصة في وسط البئر ، دون لمس قاع اللوحة.
   ملاحظه: على الرغم من أنه يمكن تعديل تنسيق الطلاء ، يوصى بعمل n = 4 آبار لكل خط من خطوط الخلايا 1-3 لكل لوحة. يتم حجز باقي اللوحة (ن = 84) لخط الخلية # 4 (خلايا المستشعر الحيوي).
6. اسمح للخلايا بالاستقرار عن طريق ترك اللوحة دون إزعاج لمدة 10 دقائق في RT. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، و ≥80٪ رطوبة نسبية.

< p class = "jove_title" >4. علاج الخلايا

ملاحظة: في اليوم التالي ، عندما تكون خلايا المستشعر الحيوي تاو متقاربة بنسبة 60-65٪ ، قم بإعداد مجمعات نقل البذور على النحو التالي:

1. في أنبوب واحد ، امزج كاشف التعداء ، مثل Lipofectamine ، مع وسائط المصل المخفضة ، مثل Opti-MEM ، لعمل مزيج رئيسي. لكل بئر ، أضف كاشف تعداء 1.25 ميكرولتر و 8.75 ميكرولتر وسائط مصل مخفضة. قم بنقر الأنبوب برفق للخلط ، ثم تدويره لفترة وجيزة ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في RT.
2. في أنبوب آخر ، امزج مادة البذور (aliquot من المحللة من الخطوة 2.9) مع وسائط المصل المخفضة.
   ملاحظه: سيختلف حجم مادة البذور وفقا للتجربة الفردية. عند اختيار حجم البذور ، ضع في اعتبارك: وفرة البذور في العينة والسمية المحتملة. يمكن أن تكون المتجانسات الخام سامة للخلايا. على هذا النحو ، استخدم أقل مستوى صوت ممكن لمراقبة التأثير المطلوب. تتراوح أحجام المحللة / البئر التي تم اختبارها مسبقا من 1-5 ميكرولتر ، أي ما يعادل 5-20 ميكروغرام من البروتين الكلي. تأكد من أن الحجم الإجمالي لكل بئر (البذور + وسائط المصل المخفض) هو 10 ميكرولتر.
3. اجمع محتويات الأنبوبين الموصوفين في 4.1 و 4.2 ، وقم بالتمرير برفق للخلط ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة (1,000 × جم ، 5 ثوان) ، واحتضن في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل وحتى ساعتين.
4. قم بتعبئة 20 ميكرولتر من مركب التحويل برفق على جانب آبار المستشعرات الحيوية الفردية. استخدم ثلاث نسخ فنية ، إن أمكن. إعادة الخلايا المعالجة إلى الحاضنة لمدة 24-48 ساعة. احتضان في ظل نفس الشروط الموضحة في الخطوة 3.6.
   ملاحظه: شرط التحكم السلبي المناسب لهذا الإعداد هو خلايا المستشعر الحيوي المعالجة بجسيمات شحمية فارغة (أي كاشف الجسيم الشحمي + وسائط مصل منخفضة) لأن تطبيق الدهون الفوسفورية يقدم تحولا طفيفا في ملف التألق بالنسبة لخلايا المستشعر الحيوي غير المعرضة لكاشف الجسيم الشحمي.

< p class = "jove_title" >5. حصاد الخلايا لقياس التدفق الخلوي FRET

ملاحظة: قبل حصاد الخلايا - بشكل عام بعد 24-48 ساعة بعد المعالجة - من الممكن الحصول على قراءة أولية لنشاط البذر باستخدام مرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) على مجهر فلوري مقلوب قياسي. ستظهر الخلايا المعالجة بدون مادة البذور (أي الجسيمات الشحمية الفارغة) مضان منتشر ، في حين أن الخلايا المعالجة بمادة البذور ستظهر شوائب ثقبية وشبكية شديدة داخل الخلايا (الشكل 1 أ - ب).

1. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بشفط كل وسط الخلية (150 ميكرولتر). قم بتدوير الخلايا (50 ميكرولتر) لمدة 5 دقائق ، وإخمادها بوسط ثقافة مبرد 150 ميكرولتر. لا تقم بتضمين شطف PBS قبل التربسين في هذه الخطوة ، لأنه قد يتسبب في شد الخلايا وفقدان الخلايا لاحقا. استبعاد أي خلايا ميتة ملوثة وحطام أثناء قياس التدفق الخلوي عبر استراتيجيات البوابات.
2. مباشرة بعد التبريد ، انقل الخلايا إلى صفيحة سفلية مستديرة 96 بئر ، وجهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
3. شفط وتخلص من الوسط ، مع الحرص على تجنب إزعاج بيليه الخلية.
4. برفق, ولكن بدقة, أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 ميكرولتر 2٪ بارافورمالدهايد, واحتضانها لمدة 10 دقائق. بدلا من ذلك, تشغيل الخلايا حية, على الرغم من أن التثبيت يوفر نتائج أنظف وأكثر اتساقا.
5. خلايا الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في RT. شفط وتخلص من بارافورمالديهايد ، مع الحرص على تجنب إزعاج حبيبات الخلية.
6. برفق ، ولكن بدقة ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي المبرد (محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) ، 1٪ FBS ، 1 ملي مولار EDTA) وقم بتشغيل اللوحة في أسرع وقت ممكن لتجنب تكتل الخلايا.

فئة

6. قياس التدفق الخلوي FRET

ملاحظة: استخدم مقياس التدفق الخلوي مثل MACSQuant VYB ، المجهز بخطوط ليزر ومجموعات مرشحات متوافقة مع FRET (الجدول 2). لكل خطوة ضمن هذا القسم ، انقر فوق البئر محل الاهتمام باستخدام قالب 96 جيدا للبرنامج ، وانقر فوق "تشغيل" لبدء امتصاص العينة وتدفقها. قم بإنشاء جداول مخططات أو إحصائيات بالنقر فوق رمز "نافذة تحليل جديدة". قم بتغيير معلمات المحور على المخططات ثنائية المتغيرات الفردية بالنقر فوق العنوان على المحور X أو Y وتحديد عامل التصفية المناسب. لتغيير مجموعات الخلايا أو إشارات التألق ، قم بزيادة أو تقليل الفولتية المرتبطة بالمرشحات المناسبة. باستخدام هذه الأداة ، قم بتشغيل <1,000 حدث / ثانية لضمان مراقبة دقيقة للخلية الواحدة.

1. قم بعمل مخطط ثنائي متغير لمنطقة التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ، ومع تشغيل خط الخلية # 1 ، اضبط جهد SSC و FSC حتى يصبح عدد الخلايا في الربع الأيسر السفلي. انقر فوق أداة المضلع، وحدد مجموعة الخلايا (البوابة P1). للحصول على جميع معلمات البوابات ، انظر الشكل 2.
2. قم بعمل مخطط ثنائي المتغير FSC-H (الارتفاع) مقابل FSC-A ، وقم بتطبيق البوابة P1 على هذه المؤامرة بالنقر فوق "مباشر" فوق المؤامرة ، وتحديد P1. مع تشغيل خط الخلية #1 ، انقر فوق أداة المضلع ، وحدد الخلايا المفردة (البوابة P2).
3. قم بعمل 3 مخططات رسم بياني ، واحدة لكل مرشح من المرشحات ذات الأهمية: CFP و YFP و FRET. قم بتطبيق البوابة P2 على كل هذه المؤامرات بالنقر فوق "مباشر" فوق قطع الأراضي ، وتحديد P2. مع تشغيل خط الخلية # 1 ، اضبط الفولتية بحيث يكون متوسط عدد الخلايا في الرسوم البيانية CFP و YFP و FRET بين 0 و 1. لقياس CFP و FRET ، قم بإثارة الخلايا باستخدام ليزر 405 نانومتر ، والتقط التألق باستخدام مرشح 450/50 نانومتر و 525/50 نانومتر ، على التوالي. لقياس YFP ، قم بإثارة الخلايا باستخدام ليزر 488 نانومتر والتقط التألق باستخدام مرشح 525/50 نانومتر. يتم وصف إعدادات الليزر والمرشح بمزيد من التفصيل في الجدول 2.
4. إجراء تعويض عن امتداد CFP إلى قنوات FRET و YFP.
   ملاحظه: التعويض هو عملية تصحيح الامتداد الفلوري. يحدث الامتداد الفلوري عندما يتم الكشف عن انبعاث مضان لفلوروكروم واحد داخل مرشح مصمم لقياس الإشارة من فلوروكروم آخر. مع التعويض المناسب ، يمكن إزالة مضان CFP غير المباشر من قنوات FRET و YFP.
   ملاحظه: يتطلب التعويض وجود كل من الخلايا الإيجابية والسالبة الفلورية. وبالتالي ، للتعويض عن الخلايا الموجبة ل CFP (خط الخلية # 2) ، يجب إضافة الخلايا السالبة (خط الخلية # 1) إلى العينة قبل التشغيل.
   1. ارتفاع في 30 ميكرولتر من تعليق خط الخلية # 1 من بئر واحد إلى 200 ميكرولتر من تعليق خط الخلية # 2 مباشرة قبل التعويض.
   2. انقر فوق رمز "إعدادات الأداة" ، ثم علامة التبويب "التعويض" ، وحدد "المصفوفة" لفتح جدول التعويضات.
   3. قم بعمل مخطط ثنائي المتغير FRET-A مقابل CFP-A ، وقم بتطبيق البوابة P2 ، كما هو موضح في الخطوة 6.3. مع تشغيل خطوط الخلايا 1 + 2 ، انقر فوق رمز "الربع" وارسم الأرباع بحيث يتم فصل المجموعات السكانية السلبية والإيجابية الفلورية بواسطة الربعين السفليين (Gates LL3 و LR3 ، على التوالي).
   4. قم بإنشاء جدول إحصائيات يعرض متوسط شدة التألق (MFI) ل FRET لبوابات LL3 و LR3. اضبط معلمة FRET في مصفوفة التعويض حتى يصبح MFI لإشارة FRET مكافئا بين LL3 و LR3. بعد هذه الخطوة ، يكون MFI لإشارة FRET متساويا بين الخلايا غير الملوثة والخلايا الإيجابية ل CFP ، مما يشير إلى عدم انتشار CFP إلى قناة FRET.
   5. قم بعمل مخطط ثنائي المتغير YFP-A مقابل CFP-A ، وقم بتطبيق البوابة P2 ، كما هو موضح في الخطوة 6.3. ارسم الأرباع (LL4 و LR4) على غرار تلك التي تم إجراؤها في الخطوة 6.4.3.
   6. قم بإنشاء جدول إحصائيات يعرض MFI ل YFP ل LL4 و LR4. اضبط معلمة YFP في مصفوفة التعويض حتى تصبح MFI لإشارة YFP مكافئة بين LL4 و LR4. بعد هذه الخطوة ، يكون MFI لإشارة YFP متساويا بين الخلايا غير الملوثة والخلايا الموجبة ل CFP ، مما يشير إلى عدم انتشار CFP إلى قناة YFP.
5. بعد إعداد البوابة والتعويض ، قم بتمييز الآبار ذات الأهمية وقم بتشغيل ما تبقى من اللوحة.
6. بعد تشغيل جميع العينات ، قم بتصدير ملفات البيانات بالنقر فوق "ملف" ، ثم "نسخ". حدد علامة التبويب "ملفات البيانات" ، وقم بتمييز مجلد التجربة ، وانقر فوق "نسخ".

النتائج

p class = "jove_content" >

< p class = "jove_content" > الجدول 1: خطوط الخلايا المستخدمة مع قياس التدفق الخلوي FRET.تستخدم خلايا HEK 293T لإعداد قياس التدفق الخلوي. تستخدم الخلايا الموجبة أحادية CFP للتعويض (*). تستخدم خلايا YFP الموجبة المفردة للتخلص من إشارة FRET الكاذبة بسبب التنشيط المباشر ل YFP بواسطة إثارة 405 نانومتر. الخلايا الإيجابية المزدوجة CFP / YFP متوافقة مع FRET وتعمل كخلايا مستشعر حيوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تبس سيغما تي 5912 مثبطات البروتياز الكاملة (خالية من EDTA) روش 4693159001 قوارير التبريد سارستيدت 72.694.006 الميزان التحليلي ميتلر توليدو XSE 105DU وزن القوارب فيشر ساينتيك 13-735-743 15 مل أنبوب مخروطي الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1475-0501 أومني سونيك روبتور الخالط بالموجات فوق الصوتية أومني انترناشيونال 18-000-115 طرف صغير للخالط بالموجات فوق الصوتية أومني انترناشيونال أو تي-156 2-بروبانول فيشر ساينتيك أ 451 أغطية الأذن المانعة للضوضاء فيشر ساينتيك 19-145-412 كيمويبس فيشر ساينتيك س 47299 أنابيب 1.5 مل الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1615-5510 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة إيبندورف 5424 000.215 DPBS تقنيات الحياة 14190-136 DMEM تقنيات الحياة 11965-084 مصل الأبقار الجنينية HyClone SH30071.03 البنسلين - ستربتومايسين تقنيات الحياة 15140-122 جلوتاماكس تقنيات الحياة 35050-061 التربسين EDTA تقنيات الحياة هاتف: 25300-054 50 مل أنابيب مخروطية أبحاث فينيكس إس إس - PH15 كاشف 25 مل VWR 41428-954 ماصة متعددة القنوات فيشر ساينتيك تي 13-690-049 96 لوحة قاع مسطح جيدا كورنينج 3603 أوبتي-ميم تقنيات الحياة 31985-070 ليبوفيكتامين 2000 إنفيتروجين 11668019 96 لوحة قاع مستديرة جيدا كورنينج 3788 ريال 16٪ بارافورمالدهيد علوم المجهر الإلكتروني الطراز RT 15710 برنامج تلفزيوني سيجما ألدريتش ص 5493 EDTA سيجما ألدريتش ED2SS HBSS تقنيات الحياة 14185-052 جهاز طرد مركزي سورفال ST 40 الترمو: العلمية 75004509 BIOLiner يتأرجح دلو الدوار الترمو: العلمية 75003796 مقياس الدم VWR 15170-172 MACSQuant VYB تدفق Cytomter ميلتيني بيوتيك 130-096-116 تيل 96 رف ميلتيني بيوتيك 130-094-459 برنامج تحليل Flow Jo تدفق جو 20 طرفا من الماصة رينين نظام تحديد المواقع العالمي (GPS-L10) 200 طرف ماصة لكل بوصة رينين نظام تحديد المواقع العالمي (GPS-250) 1 مل أطراف ماصة رينين نظام تحديد المواقع العالمي (GPS-1000) 200 طرف ماصة لكل بوصة الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-1800 5 مل ماصة مصلية أبحاث فينيكس SPG-606180 10 مل ماصة مصلية أبحاث فينيكس برنامج SPG-607180 25 مل ماصة مصلية أبحاث فينيكس برنامج SPG-760180