تقنية لتقييم التأثير المثبط للتعرض للسموم على التيارات المثيرة المصغرة بعد المشبكي (mEPSCs)

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hubbard، K. et al.، التقييم الوظيفي للسموم العصبية البيولوجية في الثقافات الشبكية للخلايا العصبية المركزية المشتقة من الخلايا الجذعية.J. Vis. Exp. (2015)

يوضح الفيديو التحليل الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية بعد التعرض للسموم العصبية. يقلل علاج هذه الخلايا العصبية بالسموم العصبية البوتولينوم من تواتر التيارات المثيرة المصغرة التلقائية بعد التشابك ، مما يؤكد تثبيط انتقال الشبكي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تكييف الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) مع ثقافة التعليق الخالية من الخلايا المغذية

1. قم بإذابة الخلايا الجذعية الجذعية عند 37 درجة مئوية حتى تبقى قطعة من الجليد.
2. باستخدام ماصة P1000، انقل برفق 1 - 2.5 × 10⁶ من ESCs المنفصلة إلى طبق غير معالج بزراعة الأنسجة يحتوي على 10 مل من وسط ESC الدافئ مسبقا. احتضان في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
3. بعد 20 ساعة ، اغسل الخلايا عن طريق نقل ثقافة التعليق برفق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. الحبيبات ESCs لمدة 3 دقائق عند 200 × جم. أثناء الدوران ، أضف 10 مل من طبق ESC الطازج المتوسط إلى المنخفض الالتصاق.
4. شفط طافي ، مع الحرص على تجنب إزاحة حبيبات الخلية ، وإضافة 1 مل من وسط ESC الطازج إلى حبيبات الخلية. انقل الخلايا إلى الطبق البكتيري باستخدام ماصة P1000 وأعدها إلى الحاضنة.
5. راقب الخلايا يوميا حتى تصبح الركام مرئية للعين المجردة (عادة 4-8 أيام (د) ؛ سيكون الركام 0.2 - 0.5 مم). إذا لم تكن المجاميع واضحة بعد 4 د ، فكرر الخطوة 1.3. بمجرد أن تصبح المجاميع مرئية ، قم بفصل ESCs والحفاظ عليها كما هو موضح في القسم 2.

2. مرور ESC وصيانته

1. انقل مجاميع ESC إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة معقمة سعة 10 مل واسمح للركام بالاستقرار في حبيبات مضغوطة (عادة من 3 إلى 5 دقائق). استنشق المادة الطافية ، مع الحرص على تجنب تعطيل حبيبات الخلية ، وغسل الركام بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 5 مل (PBS). على الرغم من أنه يوصى بتسوية الجاذبية ، إلا أنه بدلا من ذلك ، قم بتخزين خلايا الحبيبات عند 100 × جم لمدة 2.5 دقيقة بدلا من ذلك لتوفير الوقت.
2. استنشق PBS وأضف 500 ميكرولتر من التربسين. احتضان الركام في التربسين لمدة 3 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. أضف 500 ميكرولتر من وسط ESC لتخفيف التربسين وقم بترتيتر برفق 10 مرات باستخدام ماصة P1000 لتفتيت الركام. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
الخلايا
3. المنفصلة عن الحبيبات لمدة 3 دقائق عند 200 × جم وإعادة تعليق الخلايا إلى تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 10⁷ خلايا / مل في وسط ESC. انقل 150 ميكرولتر (1.5 × 10⁶ خلايا) إلى 10 مل من وسط ESC الطازج في طبق بكتيري مقاس 10 سم وأعد إلى حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة. يمكن تمييز ESCs الزائدة ، أو حفظها بالتبريد عند 1-5 × 10⁶ خلايا / مل في وسط ESC 90٪ مكمل بنسبة 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، أو التخلص منها.
4. يتجمع المرور كل 48 ساعة. ستكون الركام الجاهزة للمرور مرئية بوضوح ، بأقطار تتجاوز 0.5 مم.
   ملاحظه: يتم إذابة وزراعة الخلايا المحفوظة بالتبريد والمكيفة مع التعليق وفقا للخطوات 1.2 - 1.4. ستكون الركام جاهزة للمرور في غضون 48 - 72 ساعة.

< p class = "jove_title" >3. التمايز العصبي

ملاحظة: قم بإجراء الخطوات 3.1 - 3.5 قبل الظهر والخطوة 3.7 بعد الظهر. يتم تقديم نظرة عامة على إجراءات التمايز في الشكل 1 أ.

1. فصل ESCs كما في الخطوات 2.1 - 2.5. انقل 350 ميكرولتر (3.5 × 10⁶) من الخلايا الجذعية الكهربية المحورية المنفصلة إلى طبق منخفض التعلق مقاس 10 سم يحتوي على وسط تمايز 25 مل. ضعه على شاكر مداري مضبوطة على 30-45 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. هذا هو اليوم الأول من التمايز ، ويسمى اليوم في المختبر (DIV) -8.
   ملاحظه: يؤدي استخدام طبق ملحق منخفض للغاية إلى زيادة تكلفة الطريقة ولكنه ينتج عوائد أكبر قليلا من أطباق بتري البكتيرية لأن الركام يمكن أن يلتصق أحيانا بأطباق بتري. يمكن قياس الأحجام المتوسطة وأرقام الخلايا وفقا لذلك إذا كان يفضل أحجام الأطباق المختلفة.
2. بعد 48 ساعة (DIV -6) ، استخدم ماصة سعة 25 مل لنقل مجاميع الخلايا المتمايزة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف على الفور 25 مل من وسط التمايز الطازج إلى طبق بتري.
3. اترك الركام يستقر أكثر من 2-5 دقائق ، مما ينتج عنه حبيبات مرئية بعمق 1-2 مم. تجاهل الخلايا المفردة أو الركام الصغير المتبقي في حالة تعليق. استنشق الوسط بعناية وانقل حبيبات الخلية مرة أخرى إلى طبق بتري باستخدام P1000. ضعها على شاكر دوار في حاضنة زراعة الأنسجة.
4. في DIV -4، كرر الخطوة 3.2. سيكون عمق الحبيبات 2-4 مم. استبدل وسط التمايز 30 مل المكمل بحمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA) بطبق بتري. ارجع إلى شاكر الدوار في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة إضافية.
5. في DIV -2، كرر الخطوة 3.3. سيكون عمق الحبيبات 4-8 مم في هذه المرحلة.
6. في DIV -1 ، قم بإعداد أسطح الطلاء كما في القسم 4.
7. في DIV 0 ، قم بإذابة 5 مل من وسط التربسين للخلايا السلفية العصبية (NPC) المحتبسة مسبقا والمجمدة (NPC) عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق وضعها في غطاء مزرعة الأنسجة. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، انقل الركام المفاضل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اسمح للركام بالاستقرار وشفط الوسط بعناية. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 10 مل PBS ، مما يسمح للركام بالاستقرار بين الغسل.
8. بعد الغسيل الثاني PBS ، أضف 5 مل من وسط التربسين NPC إلى الحبيبات واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
9. أضف 5 مل من مثبط التربسين 0.1٪ من فول الصويا (STI) لتعطيل التربسين واخلطه عن طريق التقليب. قم بترتيورة برفق من 10 إلى 15 مرة باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل حتى يتم إنتاج معلق خلوي متجانس نسبيا.
10. انقل تعليق الخلية ببطء إلى مصفاة خلية 40 ميكرومتر أو 70 ميكرومتر موضوعة أعلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بمجرد تصفية كل المعلق ، أضف 1 مل من وسط N2 لغسل الخلايا المتبقية من خلال الفلتر وحبيبات تعليق الخلية المنفصلة لمدة 6 دقائق عند 200 × جم.
11. وسط الشفط دون إزعاج الحبيبات. اغسل الخلايا مرتين بوسط 10 مل N2 ، وخلايا الحبيبات لمدة 5 دقائق عند 200 × جم ، وقم بترتيتر بين الغسلات باستخدام P1000. قبل الغسيل الثاني ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم الكرياتي.
12. أعد تعليق الخلايا في وسط N2 عند 1 × 10⁷ خلايا لكل مل ولوحة الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية (ESNs) بكثافة خلية تتراوح بين 150,000 - 200,000 خلية / سم².
13. انقل ESNs المطلية حديثا إلى حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والحفاظ عليها كما في القسم 5.

< p class = "jove_title" >4. تحضير أسطح الثقافة للطلاء السلائف العصبية في DIV 0

1. قم بإعداد الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة قبل يوم واحد على الأقل من الطلاء. أضف ما يكفي من البولي إيثيلين إيثيلين (PEI ؛ 25 ميكروغرام / مل في H₂O المعقم) أو بولي دي ليسين (PDL ؛ 100 ميكروغرام / مل في H₂O المعقم) لتغطية الأطباق البلاستيكية المعالجة بزراعة الأنسجة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
2. في صباح يوم الطلاء ، اغسل الأطباق مرتين باستخدام H₂O المقطر المزدوج ومرة باستخدام PBS. بعد الغسيل النهائي ، أضف ما يكفي من وسط N2 لتغطية الطبق (على سبيل المثال ، 1 مل لكل بئر من طبق 12 بئر أو 4 مل لكل طبق 6 سم).
3. قم بإعداد أغطية زجاجية مقاس 18 مم قبل يوم واحد على الأقل من طلاء الخلايا العصبية. نظف الأغطية عن طريق تنظيف البلازما لمدة 4 دقائق.
4. انقل الغطاء الذي تم تنظيفه على الفور إلى بارافيلم مغسول بالإيثانول في قاع طبق معقم كبير وأضف 400 ميكرولتر من محلول PEI أو PDL ، المحضر كما في الخطوة 4.1. احتضان بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة.
5. في الصباح ، اغسل الأغطية ثلاث مرات بالماء وأضف 5 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS لمدة 1-3 ساعات عند 37 درجة مئوية. قبل فصل الخلايا العصبية ، قم بشفط اللامينين وانقل الغطاء على الفور إلى بئر من طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على 1 مل من وسط NPC ، مع التأكد من إبقاء الجانب المعالج متجها لأعلى.
6. قم بتخزين الأطباق والأغطية على حرارة 37 درجة مئوية حتى تصبح الشخصيات غير القابلة للعب جاهزة للطبق.

< ص الفئة = "jove_title" >5. صيانة الخلايا العصبية

1. في DIV 1 ، قم بالشفط والوسط واستبدله بوسط ثقافة N2.
2. في DIV 2 و 4 ، قم بالشفط الوسيط واستبدله بوسط استزراع B27.
3. في DIV 8 ، قم بالشفط الوسيط واستبدله بوسط ثقافة B27 الذي يحتوي على مثبطات الانقسامية للقضاء على الخلايا غير العصبية الملوثة.
4. في DIV 12، استبدل بوسط الاستزراع B27.
5. لا تقم بإزالة DIV 12⁺ ESNs من 5٪ CO₂ حتى تصبح جاهزة.

< p class = "jove_title" >6. قياس تثبيط الإرسال المشبكي (MIST) لقياس التيارات المثيرة المصغرة بعد التشابك

CAUTION: السموم العصبية المطثية هي أكثر المواد السامة المعروفة ، حيث تقدر قيم LD_{البشرية 50} بأقل من 0.1 - 1 نانوغرام / كجم. احصل على الموافقات اللازمة قبل استخدام هذه السموم واستخدم الاحتياطات المناسبة.

1. قم بتخفيف BoNT / A بعناية إلى 100x ، وهو التركيز النهائي المطلوب في وسط ثقافة ESN ، ودفئه إلى 37 درجة مئوية. أضف الحجم المناسب من السم إلى مزارع DIV 21+ ESN ، وقم بتدوير طبق الثقافة ، والعودة إلى الحاضنة.
2. إذا تم تحليل الخلايا بعد أكثر من 4 ساعات من التسمم ، أضف سما إلى الطبق وقم بتحريكه دون إزالة من 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ ، مثل الحاضنة مباشرة أو في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ الثابتة.
3. في الوقت المناسب ، قم بشفط وسط ثقافة ESN واغسله مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتسجيل خارج الخلية (ERB). أضف 4 مل من ERB مكملا ب 5.0 ميكرومتر من السموم الرباعية و 10 ميكرومتر بيكوكولين ، مما يمنع إمكانات العمل ويعددي نشاط مستقبلات GABA_A ، على التوالي.
4. انقل الطبق إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية. لا يلزم التروية أو التحكم في درجة الحرارة لمقايسة MIST.
5. اسحب زجاج البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة دقيقة لإنتاج ماصة تسجيل بمقاومة 5-10 مللي أوم وتعبئتها بمخزن مؤقت للتسجيل داخل الخلايا. اغمس ماصة التسجيل المملوءة برفق في كاشف السيليكون قبل التسجيل.
6. باستخدام حقنة مملوءة بالهواء، قم بتوفير ضغط إيجابي أثناء إنزال ماصة التسجيل في ERB. بعد هبوط ماصة التسجيل برفق على سوما الخلية العصبية ليتم تسجيلها ، قم بإزالة الضغط الإيجابي وتشكيل جيجاسيل. خفض جهد الإمساك إلى -70 مللي فولت. قم بتطبيق الضغط السلبي بعناية لاقتحام تكوين الخلية الكاملة.
7. قم بالتبديل إلى المشبك الحالي لمراقبة وتسجيل إمكانات الغشاء المريح. بدون تعديل لإمكانات التوصيل السائل ، ستكون إمكانات الغشاء المريح بين -67 و -82 مللي فولت.
8. قم بإجراء تسجيل مستمر لمشبك الجهد -70 مللي فولت لمدة 4-5 دقائق للكشف عن التيارات المثيرة المصغرة بعد التشابك (mEPSCs).
9. تحليل 4 دقائق من البيانات المسجلة للكشف عن mEPSC باستخدام برنامج الكشف عن الارتفاع بالإعدادات التالية: العتبة ، 5 ؛ فترة البحث كحد أقصى محلي ، 10,000 ميكرو ثانية ؛ الوقت قبل الذروة لخط الأساس ، 5,000 ميكرو ثانية. فترة البحث عن وقت الاضمحلال ، 20,000 ميكرو ثانية ؛ جزء من الذروة لإيجاد وقت الاضمحلال ، 0.37 ؛ الفترة لمتوسط خط الأساس ، 1,000 ميكرو ثانية ؛ عتبة المنطقة ، 20 ؛ عدد النقاط إلى متوسط الذروة ، 1 ؛ اتجاه الذروة ، سلبي.
10. جمع المعلومات عن الأحداث المكتشفة وحفظها. اقسم عدد الأحداث المكتشفة في 4 دقائق على 240 لتحديد تردد mEPSC بالهرتز.
11. اجمع ترددات mEPSC ل 8-12 وحدة تحكم و 8-12 عينة معالجة ب BoNT لكل حالة تعرض. تحليل التردد مقابل عناصر التحكم المطابقة للعمر والدفعة. تحديد الدلالة الإحصائية للنسبة المئوية لتثبيط النشاط المشبكي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه واختبار Dunnett اللاحق.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تظل شبكات ESN المتكيفة مع التعليق مستقرة من الناحية الانقسامية وتعبر عن علامات تعدد القدرات.(أ) تخطيطي لصيانة التقييم البيئي والاجتماعي والتمايز. يتميز وجود أو عدم وجود حمض الريتينويك (RA) أو عامل مثبط سرطان الدم (LIF) ب + أو -. يتم توفير مقارنة بين الأيام في المختبر (DIV) ومراحل النمو الكلاسيكية (DS) لثقافات الخلايا العصبية الأولية. (ب) ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الجدول 1. ESC و ESN خروج المغلوب DMEM تقنيات الحياة 10829-018 وسائل الإعلام: وسيط ثقافة ESC          التركيبة والملاحظات: 500 مل 100x MEM NEAA تقنيات الحياة 11140-050 الوسائط: يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد          التركيبة والملاحظات: 6 مل 200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين ATCC 30-2115 6 مل مؤهل ES FBS الخلايا الجذعية التطبيقية ASM-5007 90 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 3 مل 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول تقنيات الحياة 21985-023 1.1 مل 107 وحدة / مل LIF ميليبور ESG1107 60 ميكرولتر خروج المغلوب DMEM تقنيات الحياة 10829-018 الوسائط: وسيط التمايز ESC          التركيبة والملاحظات: 436.6 مل 100x MEM NEAA تقنيات الحياة 11140-050 الوسائط: يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد          التركيبة والملاحظات: 5 مل 200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين ATCC 30-2115 5 مل مصل مؤهل من ESC الخلايا الجذعية التطبيقية ASM-5007 50 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 2.5 مل 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول تقنيات الحياة 21985-023 0.9 مل برنامج تلفزيون Dulbecco سيجما ألدريتش د8537 الوسائط: وسط التربسين NPC          التركيبة والملاحظات: 100 مل 0.5 مليون EDTA (18.3٪) سيجما ألدريتش 3690 الوسائط: تجميد في 5 مل aliquote           التركيبة والملاحظات: 0.266 مل التربسين سيجما ألدريتش تي 8802 50 ملغ البولي إيثيلين (PEI) سيجما ألدريتش ص 3143 وسائل الإعلام: حلول طلاء الأسطح          التركيبة والملاحظات: 2.5 ميكروغرام/مل في H20 بولي د-يسين (PDL) سيجما ألدريتش P7280 الوسائط: استخدم في غضون 1 أسبوع          التركيبة والملاحظات: 100 ميكروغرام/مل في H20 لامينين سيجما ألدريتش L2020 5 ميكروغرام / مل في H20 DMEM / F12 + جلوتا ماكس تقنيات الحياة هاتف: 10565-018 وسائل الإعلام: وسيط ثقافة NPC          التركيبة والملاحظات: 492.5 مل 100x فيتامينات N2 تقنيات الحياة 17502-048 الوسائط: يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد          التركيبة والملاحظات: 5 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 2.5 مل العصبي أ تقنيات الحياة 10888-022 وسائل الإعلام: وسيط ثقافة ESN          التركيبة والملاحظات: 482.5 مل 50x فيتامين ب 27 تقنيات الحياة 17504-044 الوسائط: يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد          التركيبة والملاحظات: 10 مل 200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين ATCC 30-2115 5 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 2.5 مل 5-فلورو-2'-ديوكسيوريدين (5FDU) سيجما ألدريتش F0503 الوسائط: مثبطات الانقسامات 2000x تخزنها عند -20 درجة مئوية          الصياغة والملاحظات: dd 150 ملغ 5FDU و 350 ملغ يوريدين إلى 10 مل Neurobasal A. مرشح معقم ، aliquot وتجميد. استخدم 2000x في وسيط ثقافة ESN. أردين سيجما ألدريتش [أو3003] تريبل إكسبريس تريبسين تقنيات الحياة هاتف: 12605-010 وسائل الإعلام: متفرقات          الصياغة والملاحظات: تخزينها في RT DMSO سيجما ألدريتش د8418 المتجر في RT مثبط التربسين فول الصويا (STI) سيجما ألدريتش تي 6414 يحفظ في -20 درجة مئوية ايثانول سيجما ألدريتش E7023 المتجر في RT حمض الأسكوربيك سيجما ألدريتش أ 4403 تحضير 100 ملي من المرق عن طريق إذابة 100 مجم من حمض الأسكوربيك في 5.7 مل من مزيج DMSO / الإيثانول 50:50. حمض الريتينويك (RA) سيجما ألدريتش R2625 أعد تعليق 15 مجم RA في 9 مل 50:50 DMSO / الإيثانول. مكمل غذائي يحتوي على 1 مل من مخزون حمض الأسكوربيك 100 مل. Aliquot وتخزينها عند -80 درجة مئوية. الجدول 2. السديم كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش 71386 الوسائط: المخزن المؤقت للتسجيل خارج الخلية          التركيز النهائي (ملليمتر): 58.44          ميغاواط: 140 كيه سي إل سيجما ألدريتش 60135 الوسائط: (ERB ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3 ، 315 مللي مدراس)          التركيز النهائي (ملليمتر): 74.56          ميغاواط: 3.5 NaH2PO4 سيجما ألدريتش S3139 الوسائط: مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.          التركيز النهائي (مللي متر): 119.98          ميغاواط: 1.25 CaCl2 سيجما ألدريتش هاتف: 21115 التركيز النهائي (ملليمتر): 110.98          ميغاواط: 2 كلوريد المغنيسيوم 2 سيجما ألدريتش 63069 التركيز النهائي (ملليمتر): 95.21          ميغاواط: 1 د-الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 8644 التركيز النهائي (ملليمتر): 180.16          ميغاواط: 10 هيبس سيجما ألدريتش H0887 التركيز النهائي (ملليمتر): 238.3          ميغاواط: 10 ك-غلوكونات سيجما ألدريتش ص 1847 الوسائط: المخزن المؤقت للتسجيل داخل الخلايا          التركيز النهائي (ملليمتر): 234.5          ميغاواط: 140 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش 71386 الوسائط: (IRB ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3 ، 320 مللي مدراس)          التركيز النهائي (ملليمتر): 58.44          ميغاواط: 5 مجم - ATP سيجما ألدريتش أ 9187 الوسائط: مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.          التركيز النهائي (ملليمتر): 507.18          ميغاواط: 2 ليثيوم جي تي بي سيجما ألدريتش جي 5884 التركيز النهائي (مللي متر): 523.18          ميغاواط: 0.5 CaCl2 سيجما ألدريتش هاتف: 21115 الوسائط: مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.          التركيز النهائي (ملليمتر): 110.98          ميغاواط: 0.1 كلوريد المغنيسيوم 2 سيجما ألدريتش 63069 الوسائط: مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.          التركيز النهائي (ملليمتر): 95.21          ميغاواط: 1 EGTA سيجما ألدريتش E3889 380.35< / > الوسائط: مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل < br / > التركيز النهائي (ملليمتر): 380.35
ميغاواط: 1 هيبس سيجما ألدريتش H0887 الوسائط: مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.          التركيز النهائي (ملليمتر): 238.3          ميغاواط: 10 بيكوكولين توكرس 131 وسائل الإعلام: متفرقات          التركيز النهائي (ملليمتر): 0.01          ميغاواط: 417.85 CNQX سيجما ألدريتش سي 239 التركيز النهائي (ملليمتر): 0.01          ميغاواط: 276.12 السموم الرباعية سيجما ألدريتش أ 8001 التركيز النهائي (ملليمتر): 0.005          ميغاواط: 645.74 BoNT / A- / G ميتابيولوجيا غير متاح وسائط:          التركيز النهائي (ملليمتر): يحدد لاحقا          ميغاواط: 150,000 توكسين الكزاز سيجما ألدريتش تي 3194 التركيز النهائي (ملليمتر): يحدد لاحقا          ميغاواط: 150,000 سيجماكوت سيجما ألدريتش SL-2 التركيز النهائي (مللي متر): غير متاح           ميغاواط: غير متاح الجدول 3. المعدات والبرمجيات التحليل المصغر (الإصدار 6.0.7) شركة Synaptosoft، Inc. غير متاح برنامج الكشف عن الأحداث Igor Pro (الإصدار 6.22A) مقاييس الموجة غير متاح برنامج لتصور التسجيلات باتش ماستر هيكا غير متاح برنامج الحصول على البيانات أوليمبوس IX51 مجهر مقلوب أوليمبوس غير متاح معالج دقيق أداة سوتر MPC-365 مكبر للصوت مشبك التصحيح هيكا ECB10USB مجتذب الماصات الدقيقة أداة سوتر ف -1000 أنابيب البورسليكات الشعرية أداة سوتر ب 150-86-10 كورنينج 7740 أغطية زجاجية مقاس 18 مم صياد 12-545-84 منظف البلازما هاريك بلازما PDC-32G مصفاة الخلية (40 ميكرومتر) صياد 08-771-1 ستوفال راقصة شرقية شاكر صياد 15-453-211 أطباق منخفضة الالتصاق صياد 05-539-101 كورنينج 3262 أطباق بكتيرية VWR هاتف: 25384-302 100 × 15 ملم