إنتاج وتنقية الأجسام المضادة المؤتلفة من خلايا الثدييات

الملخص

المصدر: Shivange ، Gururaj ، et al. تحليل توزيع الورم والأنسجة للأجسام المضادة العلاجية الخاصة بالمستضد المستهدف. J. Vis. Exp.(2020).

يشرح الفيديو عملية إنتاج الأجسام المضادة في الخلايا المضيفة للثدييات ، من التعبير الجيني إلى الإفراز. يتضمن النسخ والترجمة والتعرف على الإشارة والطي الصحيح والإفراج النهائي في الوسط خارج الخلية عبر حويصلات إفرازية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التعبير عن الأجسام المضادة وتنقيتها

1. صيانة خلايا CHO
   1. قم بزراعة خلايا CHO في FreeStyle CHO Media مع مكمل الجلوتامين 1x المتاح تجاريا عند 37 درجة مئوية يهتز عند 130 دورة في الدقيقة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ باستخدام قوارير ديلونج إرلينماير ، إما زجاجية أو يمكن التخلص منها.
      ملاحظه: يوصى بشدة باستخدام قارورة محيرة بغطاء تهوية لزيادة التحريك وتحسين نقل الغاز أثناء ظروف الاهتزاز. تم الحصول على انخفاض كبير في إنتاجية الأجسام المضادة باستخدام قوارير عادية (غير محيرة) بسبب التحريض المحدود لثقافة التعليق.
   2. حافظ على عدد الخلية بين 1-5 × 10⁶ خلايا / مل مع بقاء الخلية بنسبة >95٪. إذا زاد عدد الخلية بأكثر من 5 × 10⁶ خلايا / مل ، فقم بتقسيم الخلايا. لا تسمح أبدا لخلايا CHO بالوصول إلى أقل من 0.2 × 10⁶ خلايا / مل.
2. تعداء خلايا CHO
   1. تنمو خلايا CHO في 200 مل من الوسائط (2 × 10⁶ خلايا / مل) في قوارير محيرة ديلونج Erlenmeyer.
      ملاحظه: لطالما أنتجت الثقافات المعلقة المزروعة في قوارير محيرة إنتاجية أعلى من البروتين مقارنة بزراعتها في قوارير غير محيرة.
   2. في أنبوب سعة 15 مل ، خذ 5 مل من وسائط CHO FreeStyle وأضف 50 ميكروغرام من الحمض النووي لاستنساخ VH و 75 ميكروغرام من الحمض النووي لاستنساخ VL. دوامة لخلط جيدا.
   3. احتضان خليط الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: الحضانة الأطول تقلل من غلة البروتين.
   4. أضف 750 ميكرولتر من مخزون 1 مجم / مل من البولي إيثيلين إيثيلين (PEI) إلى محلول الحمض النووي وقم بدوامة الخليط بقوة لمدة 30 ثانية. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إضافية < br / > ملاحظه: يجب أن يكون PEI طازجا. تقلل دورة الذوبان المتعددة في التجميد في جزيرة الأمير إدوارد من العائد الإجمالي بشكل كبير.
   5. أضف الخليط الكامل من الحمض النووي وجزيرة الأمير والأمير إدوارد إلى الخلايا أثناء هز القارورة يدويا. احتضان قوارير Erlenmeyer المحيرة على الفور مع الخلايا عند 37 درجة مئوية تهتز عند 130 دورة في الدقيقة.
3. تعبير
   ملاحظة: يحتوي الجسم المضاد على ببتيد إشارة إفرازي مصمم على نهايته الطرفية N ، مما يساعد على إفراز الأجسام المضادة في الوسائط.
   1. قم بزراعة الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة في اليوم الأول.
   2. في اليوم 2 ، أضف 2 مل من 100x عامل مضاد للتكتل و 2 مل من محلول مضاد للبكتيريا والفطريات 100x. قم بتحويل القارورة إلى درجة حرارة منخفضة (32-34 درجة مئوية) ، مع الاهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة.
   3. في كل يوم خامس ، أضف 10 مل من علف التربتون N1 و 2 مل من مكمل الجلوتامين 100x.
   4. استمر في عد الخلايا كل ثلاثة أيام باستخدام مقياس كثافة الدم بعد تلطيخ جزء من الخلايا ببقعة زرقاء مثقب. تأكد من بقاء صلاحية الخلية أعلى من 80٪.
   5. في اليوم 10 أو 11 ، احصد الوسط لتنقية الأجسام المضادة. قم بتدوير المزرعة عند 3000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 40-60 دقيقة ثم قم بتصفية الوسائط الشفافة باستخدام مرشحات زجاجة 0.22 ميكرومتر.
4. تنقية
   ملاحظه: يتم إجراء تنقية الأجسام المضادة باستخدام عمود بروتين-أ المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) ، باستخدام مضخة تمعجية.
   1. قم بموازنة العمود بحجم عمودين من المخزن المؤقت الملزم (20 ملي مولار فوسفات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4).
   2. قم بتمرير الوسائط المفلترة التي تحتوي على جسم مضاد (تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.5) عبر العمود بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
   3. اغسل العمود بحجم من عمودين من المخزن المؤقت الملزم.
   4. قم بتقطيع الجسم المضاد إلى 500 ميكرولتر باستخدام مخزن مؤقت للشطف 5 مل (30 ملي مولار من أسيتات الصوديوم عند درجة الحموضة 3.4).
   5. قم بتحييد الرقم الهيدروجيني للجسم المضاد الملطوع بإضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحييد (3 M من أسيتات الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 9) لكل جزء.
      ملاحظه: تحتوي أرقام الكسور 3-6 على معظم الجسم المضاد. ينصح بالاحتفاظ بجميع الكسور في حالة تقويض الجسم المضاد في جزء لاحق مما كان متوقعا.
   6. قم بقياس تركيز الجسم المضاد المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق تحديد البروتوكول الافتراضي ل IgG. يتم الحصول على التركيز النهائي للجسم المضاد بالملغم / مل من خلال النظر في الوزن الجزيئي ومعامل الامتصاص.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسائط فري ستايل CHO جيبكو لايف تكنولوجيز القط # 12651-014 مضاد مضاد (100X) جيبكو لايف تكنولوجيز قطة # 15240-062 عامل مضاد للتكتل جيبكو لايف تكنولوجيز القط # 01-0057DG حقنة الأنسولين BD BD العلوم البيولوجية قطة # 329420 طيف الفرجار IVIS بيركين إلمر القط # 124262 CHO CD EfficientFeed B جيبكو لايف تكنولوجيز القط #A10240-01 كورنينج 500 مل DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) كورنينج قطة # 10-13-السيرة الذاتية كورنينج 500 مل RPMI 1640 كورنينج قطة # 10-040-السيرة الذاتية Cy5 المترافق المضاد للإنسان IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية قطة # 709-175-149 جلوتا ماكس الأول (100X) جيبكو لايف تكنولوجيز قطة # 35050-061 طقم HiPure Plasmid Maxiprep إنفيتروجين قطة # K21007 HiTrap Mabحدد عمود SuRe جنرال إلكتريك للرعاية الصحية القط # 11-0034-93 إيزوفلوران ، USP كوفيتروس قطة # 11695-6777-2 مرهم العين المزيوت تحديث Lacri-Lube قطة # 4089 كاشف تعداء PEI ثيرمو فيشر القط # BMS1003A النماذج التجريبية: خطوط الخلايا الإنسان: OVCAR-3 مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC HTB-161 الإنسان: خلايا CHO-K إسطبل متحول في مختبرنا ATCC CCL-61 الماوس: 4T1 هدية طيبة من الدكتور تشيب لاندن ، UVA الماوس: MC38 هدية طيبة من الدكتورة سوزان أوستراند روزنبرغ ، UMBC تمت المصادقة عليها بواسطة التنميط STR