مقالة منهجية

قياس تنشيط وظائف المستجيب بوساطة FC بواسطة الأجسام المضادة ل HA

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Bailey، M.J.، et al. طريقة لتقييم وظائف المستجيب بوساطة FC الناجمة عن الأجسام المضادة المحددة للهيماجلوتينين في الأنفلونزا. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا يقيس التنشيط بوساطة الجسم المضاد لوظائف مستجيب الخلايا التائية. تؤدي إضافة جسم مضاد أحادي النسيلة خاص بفيروس الهيماجلوتينين (HA) إلى خلايا الثدييات المنقولة التي تعبر عن HA إلى تكوين مجمعات مناعية مع HA. عند إدخال الخلايا التائية المهندسة التي تعبر عن مستقبلات Fc ومراسل لوسيفيراز ، يتم تنشيط الخلايا التائية بواسطة مجمعات الأجسام المضادة-HA ، ويتم الكشف عن هذا التنشيط عن طريق إضافة ركيزة لوسيفيراز وقياس التلألؤ البيولوجي المنتج.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. التعبير عن فيروس الأنفلونزا الهيماجلوتينين عن طريق التعدي

  1. صفيحة خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK 293T) بكثافة 2 × 104 خلايا / بئر في مزرعة الأنسجة البيضاء المعالجة صفيحة 96 بئر واتركها لمدة 4 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2).
  2. الخلايا الشفافة مع 100 نانوغرام من ترميز الحمض النووي للهيماجلوتينين الفيروسي و 0.2 ميكرولتر من كاشف التعدي لكل بئر في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر.
    ملاحظه: يتم تخفيف كل من الكاشف البلازميد والراشف في 1x Opti-Minimum Essential Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
  3. بعد احتضان الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 18 ساعة ، قم بإزالة وسائط التعداد.
< p class = "jove_title" >2. تقييم التنشيط بوساطة FcRg / NFAT لنشاط لوسيفيراز بواسطة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو الأمصال

  1. أولا ، استبدل وسط نمو الخلايا المنقولة ب 25 ميكرولتر من وسائط الفحص (1x RPMI 1640 مكملا بنسبة 4٪ (حجم / حجم) منخفض IgG من الأبقار الجنينية).
  2. في لوحة منفصلة مكونة من 96 بئرا ، قم بإجراء تخفيفات بأربعة أضعاف للأجسام المضادة ذات الأهمية بدءا من 30 ميكروغرام / مل باستخدام وسائط الفحص. قم بإجراء التخفيفات في ثلاث نسخ ، ويوضح مثال تخطيط اللوحة في الشكل 1 أ. تأكد من تضمين عنصر تحكم يستبعد الأجسام المضادة (لا يوجد تحكم في الأجسام المضادة) والتحكم في الخلفية (المخزن المؤقت للفحص وحده><). ملاحظه: لكل من "عدم وجود جسم مضاد" وعناصر التحكم في الخلفية ، أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص بدلا من الجسم المضاد.
  3. نقل 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة تسلسليا من الخطوة 2.2 إلى الآبار المقابلة على صفيحة الخلايا المنقولة.
  4. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لمدة 15 دقيقة.
  5. أضف 25 ميكرولتر من الخلية المستجيب المعدل المناسب Jurkat التي تعبر عن الفئران FcgRIV أو FcgRIIIa البشري (75,000 خلية / بئر). يجب أن يكون الحجم الإجمالي لكل بئر 75 ميكرولتر ، ويكون التركيز النهائي الأولي للجسم المضاد عند 10 ميكروغرام / مل (الشكل 1 ب).
    ملاحظه: بالنسبة للتحكم في الخلفية، أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص بدلا من خلايا المستجيب. لفحص البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة ، يمكن استخدام خلية جوركات معدلة تعبر عن FcgRIIa البشري.
  6. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6 ساعات.
  7. قم بإذابة وتسخين الركيزة اللوسيفيراز في ماء 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل الاستخدام.
    ملاحظه: لعمل المخزن المؤقت للركيزة لوسيفيراز ، أعد تشكيل ركيزة فحص لوسيفيراز المجففة بالتجميد في المخزن المؤقت للفحص المقدم. يمكن تخزين المخزن المؤقت للركيزة المعاد تكوينه عند -30 درجة مئوية إلى -10 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أسابيع.
  8. أضف 75 ميكرولتر / بئر من المخزن المؤقت لركيزة لوسيفيراز إلى جميع الآبار باستثناء التحكم في الخلفية.
  9. اقرأ على مقياس الإضاءة.
  10. احسب تحريض الطية بالمعادلة التالية: تحريض الطي = (القيمة المستحثة - قيمة الخلفية) / (لا توجد قيمة mAb - قيمة الخلفية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتخطيط لوحة العينة وتكوين المجموعات التجريبية. (أ) يكون تركيز البداية لكل عينة من الأجسام المضادة عند 10 ميكروغرام / مل ويتم تخفيفه بشكل متسلسل عبر اللوحة (العمود 1 إلى العمود 12) 4 أضعاف. يتم عمل كل عينة في ثلاث نسخ. الصف G محجوز لعنصر التحكم بدون mAb ، والصف H هو الخلفية. (ب) الحجم النهائي لكل مجموعة تجريبية قبل إضافة مخزن الركيزة لوسيفيراز هو 7...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا HEK 293T ATCC CRL-3216 خلايا الكلى الجنينية البشرية ليبوفيكتامين 2000 تقنيات الحياة 11668019 كاشف التعداء 1X Opti-MEM مصل متوسط ثيرموفيشر العلمي 51985-034 عالجت زراعة الأنسجة البيضاء لوحة 96 بئر شركة كورنينج 3917 لوحات الفحص 10X MEM جيبكو 11430-030 خلية جوركات تعبر عن الفئران FcgRIV بروميجا م 1201 توفر المجموعة الخلايا ونظام فحص Bio-Glo Luciferase و 1X RPMI ومصل IgG منخفض خلية Jurkat التي تعبر عن FcgRIIIa البشري بروميجا جي 7010 توفر المجموعة الخلايا ونظام فحص Bio-Glo Luciferase و 1X RPMI ومصل IgG منخفض خلية جوركات تعبر عن FcgRIIa البشري بروميجا جي 9901 توفر المجموعة الخلايا ونظام فحص Bio-Glo Luciferase و 1X RPMI ومصل IgG منخفض مقياس الإضاءة بيوتك قارئ Synergy H1 متعدد الأوضاع قارئ لوحة التلألؤ نظام فحص Bio-Glo Luciferase بروميجا جي 7940 يحتوي على مخزن فحص لوسيفيراز وركيزة فحص لوسيفيراز

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HA NFAT Jurkat

مقالات ذات صلة