توليد متغيرات هروب فيروس الأنفلونزا ضد الأجسام المضادة المعادلة

ملاحظة: يمكن تصنيف الأجسام المضادة الخاصة ب HA والتي تمنع تكاثر الفيروس بشكل عام إلى أنا) تلك التي ترتبط بموقع ربط المستقبل أو مجاوره أعلى الرأس الكروي و ب) تلك التي تربط بعيدا عن مجال ربط المستقبل ، والذي يتضمن الجانب الجانبي للرأس الكروي ومنطقة ساق HA. تمنع الأجسام المضادة التي تستهدف موقع ربط المستقبلات من اشتباك أشكال حمض السياليك على سطح الخلايا المستهدفة ويمكن قياسها باستخدام اختبار تثبيط التخثر الدموي (HI). لا يزال بإمكان الأجسام المضادة السلبية HI ، مثل الأجسام المضادة الخاصة بالساق ، تمنع تكاثر الفيروس ، ولكن لا يمكن تقييمها إلا باستخدام فحوصات التحييد.

1. تصنيف الأجسام المضادة بناء على أنشطة HI

1. اختبار HI
   1. في لوحة قاع V سعة 96 بئرا ، أضف 25 ميكرولتر من 1x PBS على الأعمدة من 2 إلى 12.
   2. تمييع الجسم المضاد أحادي النسيلة (mAb) 7B2 (خاص بالرأس) و 6F12 (خاص بالساق) والتحكم في النمط المتماثل إلى 100 ميكروغرام / مل في 1x PBS ومقدار 50 ميكرولتر من مستحضرات الأجسام المضادة المخففة في العمود 1. أيضا ، قم بتضمين عنصر تحكم بدون mAb عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) (الشكل 1 أ).
   3. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية ثنائية الأضعاف للأجسام المضادة عن طريق نقل 25 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 ، وهكذا دواليك. تخلص من آخر 25 ميكرولتر من العمود 12 (الشكل 1 أ).
      ملاحظه: تأكد من تضمين صف من عدم التحكم في الأجسام المضادة.
   4. تمييع مخزون الفيروس (فيروس معاد تشكيله يعبر عن الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) في A/California/04/09 مع الأجزاء الداخلية من A/Puerto Rico/8/34) إلى 8 وحدات تضخم الدموية/25 ميكرولتر مخزون الفيروس المخفف. أضف 25 ميكرولتر من مخزون الفيروس المخفف (8 تراخي الدم) إلى كل بئر (الصفوف A إلى G).
      ملاحظه: يجب أن يكون حجم الأجسام المضادة وخليط الفيروسات 50 ميكرولتر مع تركيز نهائي يبدأ يبلغ 50 ميكروغرام / مل.
   5. احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 45 دقيقة.
   6. بالنسبة لصف المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي (H)، أضف 50 ميكرولتر من 1x PBS على الآبار H2 إلى H12. أضف 100 ميكرولتر من 8 وحدات تضخم الدم / 25 ميكرولتر إلى البئر H1. قم بالتخفيف المتسلسل مرتين عن طريق نقل 50 ميكرولتر من H1 إلى H2 ، وهكذا دواليك. تخلص من آخر 50 ميكرولتر من البئر H12. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء للدجاج بنسبة 0.5٪ (RBC) إلى جميع آبار اللوحة السفلية على شكل حرف V المكونة من 96 بئرا.
      ملاحظه: يجب أن يكون لعينات mAb في الفحص حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر: mAb (25 ميكرولتر) ، فيروس (25 ميكرولتر) وكرات الدم الحمراء (50 ميكرولتر). وينبغي أن يحتوي الحجم النهائي للتحكم الذي لا يحتوي على mAb على 25 ميكرولتر من 1x PBS و25 ميكرولتر من الفيروس و50 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء.
   7. احتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
   8. اقرأ اللوحات بصريا لنشاط HI. إذا كانت هناك قراءة إيجابية لجسم مضاد معين ، فانتقل إلى الخطوة 2.1 لتوليد متغيرات الهروب. إذا كان الجسم المضاد سلبيا ، فانتقل أدناه إلى الخطوة 1.2 لتقييم ما إذا كان الجسم المضاد له نشاط تحييد في مقايسة زراعة الخلية.
      ملاحظه: يشار إلى القراءة الإيجابية ل mAb النشط HI بواسطة حبيبات كرات الدم الحمراء الحمراء الداكنة في وسط البئر (الشكل 1 ب ؛ 7 ب 2) والتي ستشكل قطرة دمعة عندما يتم تثبيت اللوحة القاعية على شكل حرف V المكونة من 96 بئرا بزاوية 45 درجة. لن تشكل القراءة السلبية حبيبات كرات الدم الحمراء الداكنة في البئر (الشكل 1 ب ؛ 6F12 ولا يوجد مللي أمبير). لن يشكل التحكم في النمط المتماثل أيضا حبيبات كرات الدم الحمراء الحمراء الداكنة ويجب أن يبدو متطابقا مع الجسم المضاد الخاص بالساق ، 6F12 أو عينة التحكم بدون mAb (الشكل 1 ب).

2. توليد متغيرات Escape Mutant

ملاحظة: يتم تحليل تحييد الأجسام المضادة التي لديها أو تفتقر إلى نشاط HI باستخدام البروتوكولات المحددة الموضحة أدناه.

1. البروتوكول 1: الأجسام المضادة الإيجابية / إيجابية التحييد (الشكل 2 أ)
   1. قم بإعداد مخزون فيروسي من 10⁶ وحدات تشكيل البلاك / المليلتر (PFU / مل) في 1x PBS بحجم 400 ميكرولتر.
   2. قم بإعداد أربعة تخفيفات من الجسم المضاد ذي الأهمية في زيادة التركيزات (على سبيل المثال ، 0 و 0.5 و 0.05 و 0.005 مجم / مل) في 1x PBS بحجم 100 ميكرولتر لكل تخفيف.
      ملاحظة: يجب دائما تمرير الفيروس من النوع البري بالتوازي وفي حالة عدم وجود جسم مضاد. ستساعد تسلسل هذه الفيروسات المنقولة في التمييز بين التكيف مع ظروف زراعة الخلايا وطفرات الهروب.
   3. امزج 100 ميكرولتر من 10⁶ PFU / مل من الفيروس مع 100 ميكرولتر من كل تخفيف للأجسام المضادة أو 100 ميكرولتر من 1x PBS.
   4. احتضن لمدة ساعة واحدة في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂). دوامة لفترة وجيزة. حقن 200 ميكرولتر من كل خليط في بيض دجاج مجنم وخالي من مسببات الأمراض (SPF).
   5. احتضان البيض عند 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 40-44 ساعة.
   6. التضحية بالبويضات المجنمنة بالفيروس عن طريق الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات على الأقل.
   7. احصد السائل الألانتوي من البيض ، كما هو موضح سابقا.
   8. قم بإجراء مقايسة التضخم الدموية ، كما هو موضح أعلاه. إذا لم تكن جميع مستحضرات السائل آلانتويك تحتوي على عيار تضخم الدم، كرر ذلك من الخطوة 2 مع تخفيفات الأجسام المضادة التي تتراوح من 0.005 ملغم/مل إلى 0.00005 ملغم/مل.
      ملاحظه: قد يؤدي التركيز المشبع للجسم المضاد الإيجابي HI إلى تحييد جميع جزيئات الفيروس الموجودة. لذلك ، قد يكون من الضروري تقليل كمية الجسم المضاد الموجودة في الممر.
   9. قم بتأكيد متغيرات الهروب عن طريق إجراء مقايسة HI (الخطوة 1.1).
      ملاحظه: تمنع الأجسام المضادة النشطة HI اشتباك حمض السياليك في حمض السياليك على الخلايا المستهدفة. لذلك ، يفقد الفيروس في وجود جسمه المضاد المماثل القدرة على تراص كرات الدم الحمراء (وجود حبيبات كرات الدم الحمراء). من الناحية النظرية ، لا يزال بإمكان متغيرات الهروب من الأجسام المضادة النشطة HI ربط أشكال حمض السياليك حتى في وجود جسمها المضاد المماثل ، وبالتالي يمكنها تراص كرات الدم الحمراء (بدون حبيبات كرات الدم الحمراء). إذا كان HI للجسم المضاد المعني لا يزال قابلا للاكتشاف ، فكرر البروتوكول من الخطوة 2.1.2 بتركيز بدء أعلى للجسم المضاد.

الشكل 1: اختبار HI. (أ) مخطط لإعداد اختبار HI لاختبار نشاط اثنين من mAbs 7B2 الخاصين بالفأر H1 (خاص بالرأس) و 6F12 (خاص بالساق) باستخدام لوحة قاع V ذات 96 بئرا ، و (ب) مثال على نتائج اختبار HI

الشكل 2: جيل المسوخ الهروب. ستعتمد المنهجية المقترحة على HI ونشاط التحييد الدقيق الذي يظهره الجسم المضاد. قد يتطلب توليد طفرات الهروب ضد (أ) تحييد الأجسام المضادة الإيجابية HI ممرا واحدا في البيض ، بينما (ب) قد يتضمن تحييد الأجسام المضادة السلبية HI ممرات متعددة مع زيادة كميات الأجسام المضادة في زراعة أنسجة الخلايا.