توليد الأجسام المضادة أحادية النسيلة المؤتلفة من مزارع خلايا الثدييات

الملخص

المصدر: Nogales-Gadea ، G. et al. ، توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البشرية المؤتلفة IgG من الخلايا البائية المصنفة الخالدة.J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد الأجسام المضادة من خلايا الثدييات عن طريق إدخال نواقل البلازميد ذات جينات السلسلة الثقيلة والخفيفة. تتفاعل هذه النواقل مع بولي إيثيلينيميني وتدخل الخلايا عن طريق تشكيل ممرات متعددة. في وقت لاحق ، يتم ترجمتها إلى بروتينات فردية وتجميعها في أجسام مضادة كاملة ، والتي تفرز في الوسط خارج الخلية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs)

1. جهاز طرد مركزي 25 مل من الدم الهباريني للمشاركين عند 900 × جم لمدة 15 دقيقة ، في أقرب وقت ممكن بعد استخراج الدم. إذا كان هناك دم أقل ، فقم بتقليص الكواشف وفقا لذلك. قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في غطاء المحرك.
2. انقل المصل إلى أنبوب نظيف. يمكن استخدامه في خطوات لاحقة لتجميد PBMCs أو في حالة مرضى المناعة الذاتية ، لاختبار الأجسام المضادة الذاتية.
3. قم بتخفيف الدم ب 10 مل من وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
4. أضف 15 مل من محلول يحتوي على عديد السكروز ودياتريزوات الصوديوم (1.077 جم / مل) إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
ضع
5. طبقة من الدم برفق فوق المحلول في الخطوة 1.4 عن طريق تقريب فتحتي الأنابيب من بعضهما البعض حتى يتلامس السائلان ببطء شديد ، ثم قم بصب معلق PBMC ببطء فوق أنبوب 50 مل. هذه الخطوة ضرورية للحصول على فصل جيد بين PBMCs.
6. جهاز الطرد المركزي الأنبوب الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.5 عند 400 × جم بدون فرامل في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
7. بعد الطرد المركزي ، استرجع باستخدام الماصة الحلقة البيضاء التي تظهر في الجزء الأوسط من الأنبوب ، والتي تحتوي على PBMCs.
8. اغسل الخلايا ب 25 مل من وسائط RPMI 1640.
9. جهاز طرد مركزي 300 × جم عند RT لمدة 10 دقائق.
10. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا ب 10 مل من RPMI 1640. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى كما في الخطوة 1.9.
11. عد PBMCs مع غرفة Neubauer كما ورد سابقا.
12. قم بمعالجة PBMCs كما في القسم 2 أو قم بتخزينها لاستخدامها لاحقا على النحو التالي: 10 ملايين PBMCs للتجميد لكل أنبوب تبريدي مخفف في 1 مل من 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 90٪ مصل تم الحصول عليه في الخطوة 1.2. قم بالتجميد تدريجيا وللتخزين الطويل في النيتروجين السائل.

< p class = "jove_title" >2. تلطيخ PBMCs لفرز CD22 + والغلوبولين المناعي G (IgG +) عن طريق قياس الخلايا

الخلوية

1. قم بوضع PBMCs في قارورة ثقافة خلية مقاس 25 سم مع 6 مل من وسط RPMI 1640 الكامل (مكمل ب L-glutamine ، و 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك (HEPES) عازلة ، 50 وحدة / مل بنسلين ، 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 10٪ من مصل الأبقار الجنينية) واتركها تستعيد O / N في الحاضنة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
2. قم بحظر أنابيب فرز الخلايا المنشطة بالفلورة المعقمة (FACS) بمحلول ملحي معقم 4٪ من فوسفات الألبومين (PBS) طوال الليل (O / N). اغسل الأنابيب مرتين باستخدام PBS واملأها ب 500 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الكامل. استخدم هذه الأنابيب لاستعادة الخلايا بعد الفرز.
3. اجمع PBMCs في أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم عند RT لمدة 5 دقائق.
4. قم بإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للتسمية (انظر الخطوتين 2.5 و 2.6) وقم بحسابها. المخزن المؤقت لوضع العلامات عبارة عن مصل بقري جنيني معقم بنسبة 2٪ و 1 ملي مولار حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) في PBS.
5. قم بإعداد 3 أنابيب FACS مع 10 5 خلايا لكل منها وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات. ستعمل هذه الأنابيب على تحديد بوابات الفرز.
   1. في الأنبوب الأول ، أضف 5 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد CD22 PerCP (موصى به في ورقة بيانات الشركة المصنعة) ، في الأنبوب الثاني 20 ميكرولتر من مضاد IgG PE (موصى به في ورقة بيانات الشركة المصنعة) ، ولا شيء في الأنبوب الثالث. احتضن على الجليد وفي الظلام خلال 30 دقيقة.
6. أعد تعليق 5 ملايين خلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات في أنبوب FACS وأضف 10 ميكرولتر من مضاد CD22 PerCP و 40 ميكرولتر من مضاد IgG PE. احتضان الخلايا على الجليد والظلام خلال 30 دقيقة. إذا كان فرز عدد أكبر من الخلايا مطلوبا ، فقم بتوسيع نطاق جميع الكواشف.
7. خلايا الطرد المركزي عند 400 × جم مع فرامل منخفضة لمدة 5 دقائق في RT.
8. صب بهدوء طاف.
9. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات. خلايا الطرد المركزي عند 400 × جم مع فرامل منخفضة لمدة 5 دقائق في RT. كرر الخطوتين 2.7 و 2.8
10. صب بلطف المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة.
11. مرر الخلايا عبر مرشح 0.45 ميكرومتر. الخلايا جاهزة للفرز.

< p class = "jove_title" >3. فرز الخلايا البائية CD22 + و IgG +

1. استخدم 3 أنابيب تحكم لتحديد صلاحية الخلايا. في عنصر التحكم بدون تلطيخ ، استخدم مخطط مبعثر أمامي وحجم لتحديد بوابات الخلايا الليمفاوية. تعمل عناصر التحكم المزودة ب CD22 PerCP و anti-IgG PE على إنشاء البوابات وبوابة الفرز. تنفيذ البيانات التالية التي تم الإبلاغ عنها مسبقا.
   ملاحظة: البوابة هي مجموعة من حدود القيمة (الحدود) التي تعمل على عزل مجموعة معينة من أحداث القياس الخلوي ، في خلايا حالتنا ، من مجموعة كبيرة. في حالة بوابة الفرز ، تسمح حدود القيمة باسترداد الأحداث القياسية الخلوية ، الخلايا ، التي تقع داخل الحدود المحددة: CD22 + و IgG +.
2. كأنبوب تجميع في الفرز ، استخدم الأنابيب المسدودة مع 500 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الكامل ، الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.2.
3. تابع الفرز الإيجابي المزدوج: CD22 + IgG +. لاحظ العدد النهائي للخلايا في كل حالة. قم بفرزها فوق الخلايا المغذية في أسرع وقت ممكن.

< p class = "jove_title" >4. تشعيع الخلايا المغذية

ملاحظة: قم بإجراء تحضير خلايا التغذية بين 1 - 3 أيام قبل الفرز. هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 5,000 خلية wi38 لكل بئر في لوحة بئر مستديرة 96. قم بتنفيذ الخطوات 4.1 و 4.2 و 4.4 في غطاء المحرك.

1. قم بزراعة خلايا wi38 عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في وسط RPMI 1640 كامل (كما هو الحال بالنسبة ل PBMCs) حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الخلية.
2. قم بإشعاعها عند 50 رمادي ، باتباع بروتوكول موصوف من قبل. قم بإجراء التشعيع بمجرد أن يتم تربسين خلايا wi38 وإعادة تعليقها في وسط RPMI كامل ، أو مع توصيل wi38 بقارورة الثقافة والتربسين بعد التشعيع. اتبع طريقة التربسين التي أشار إليها مورد خلايا wi38. قم بتشعيع عدد الخلايا اللازمة لتغطية الآبار اللازمة لطلاء خلايا IgG + B (1٪ من إجمالي PBMC المحسوبة في الخطوة 1.11).
3. لوحة 90 ميكرولتر تحتوي على 5,000 خلية wi38 مشعة في كل بئر من لوحة البئر المستديرة 96. اترك الآبار في الصف الخارجي من اللوحة فارغة (لأنها تتبخر بشكل أسرع) ، واستخدم فقط 60 بئرا في منتصف اللوحة لخلايا الطلاء. املأ الآبار الخارجية التي تؤطر اللوحة ب 200 ميكرولتر من PBS.
4. ضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، لحين الحاجة.

< p class = "jove_title" >5. طلاء PBMCs المصنفة ، عدوى فيروس إبشتاين بار (EBV) ونموها

1. قم بتخفيف PBMCs التي تم فرزها ، لصفيحة 50 خلية في 50 ميكرولتر من RPMI 1640 وسط كامل لكل بئر في لوحة البئر المستديرة 96 (مطلية مسبقا بخلايا wi38 مشعة). قم بتنفيذ الخطوات في غطاء المحرك المجهز لعمل EBV.
   ملاحظة: تم تحسين إصابة 50 خلية لكل بئر وتزيد من التشابه لإنتاج جسم مضاد وحيد النسيلة ، ومع ذلك ، يوصى بالتحقق من ذلك عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كما هو موضح من قبل.
2. أضف 60 ميكرولتر من المادة الطافية EBV (تحتوي على 3-4 × 10⁸ نسخ فيروسية / مل) إلى كل بئر في لوحة البئر المستديرة 96. يجب توخي الحذر أثناء عمل EBV.
3. أضف 1 ميكروغرام / مل من CpG (ODN2006) لكل بئر.
4. اترك الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
5. راقب بصريا الاستنساخ الذي ينمو تحت المجهر بعد أسبوع واحد.
   ملاحظة: يمكن رؤية بعض الأمثلة على نمو الخلايا البائية أدناه في قسم النتائج. لاحظ أن معدلات نمو المستنسخة قد تختلف ، وقد يكون من الضروري قضاء وقت إضافي لبدء رؤية بعض كتلة الخلايا تنمو في منتصف البئر.
6. بعد 1^{أسبوعين} راقب الاستنساخ ينمو تحت المجهر الضوئي وانتقل إلى أول تبادل للوسائط. قم بإخراج 90 ميكرولتر من الوسط ببطء من الجزء العلوي من البئر واجمعها في طبق نظيف مكون من 96 بئرا. (تقع الخلايا البائية في قاع البئر ، لذلك لا يوجد خطر في شفطها).
   1. أضف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من وسائط RPMI 1640 الكاملة المكملة ب 1 ميكروغرام / مل من CpG (ODN2006) و 50 وحدة / مل من IL2. إذا كانت المستنسخة تنمو ، فقم بتحليل هذا التبادل الأول للوسائط عن طريق مقايسة المواد الماصة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) كما في الخطوة 6.
7. راقب نمو الاستنساخ وقم بتغيير الوسائط بعد الأسبوع الثالث والرابع من النمو مرة أخرى عن طريق أخذ 90 ميكرولتر من الوسائط وإضافة 100 ميكرولتر من وسائط RPMI 1640 الكاملة المكملة ب 1 ميكروغرام / مل من CpG (ODN2006) و 50 وحدة / مل من IL2. استخدم المادة الطافية التي تم جمعها لمراقبة إنتاج IgG بواسطة ELISA كما في الخطوة 6.
   ملاحظة: بعد شهر واحد ، يجب أن يكون نمو الاستنساخ واضحا من خلال مراقبة مجاميع الخلايا المستديرة التي تقع عادة في منتصف بئر القاع المستدير.
8. في هذه الخطوة ، قم بتغيير الوسائط بنفس الطريقة التي كانت بها الأسابيع السابقة ولكن فقط باستخدام وسائط RPMI 1640 الكاملة. من المؤشرات الجيدة لمعرفة اللحظة المناسبة لتغيير الوسائط لون الوسائط ، إذا أصبحت خلايا صفراء تحتاج إلى تبادل الوسائط.
9. عندما تحتوي الألواح المكونة من 96 بئرا على نسخ كبيرة (حوالي 5 × 10⁵ خلايا) ، انقلها إلى بئر مسطح من صفيحة 24 بئرا. أضف 300 ميكرولتر من وسائط RPMI 1640 الكاملة إلى البئر الجديد. أعد تعليق الاستنساخ المكون من 96 بئرا ، عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ونقل الخلايا إلى البئر الجديد ، وتوزيعها بشكل متجانس. أضف وسائط جديدة عند الحاجة.
   1. عندما تمتلئ آبار الصفيحة المكونة من 24 بئرا بالخلايا (حوالي 5 × 10⁶ خلايا) ، انقلها إلى بئر مسطح من صفيحة مكونة من 6 آبار. أضف 2 مل من وسائط RPMI 1640 الكاملة إلى البئر الجديد. أعد تعليق الخلايا في الصفيحة المكونة من 24 بئرا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات ، وتوزيعها بشكل متجانس في البئر الجديد.
10. أضف الوسائط عند الحاجة. إذا لم يتم الحفاظ على الخلايا في المزرعة ، فقم بتكسير الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بتخزين المواد الطفية لاختبار ELISA. اغسل حبيبات الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 × PBS ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وخزنها جافة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
    1. عندما تصبح الخلايا الموجودة في الصفيحة المكونة من 6 آبار ملتقية (حوالي 20 × 10⁶ خلايا) ، انقلها إلى لوحة ثقافة 60 مم. أضف 4 مل من وسائط RPMI 1640 الكاملة إلى اللوحة الجديدة. أعد تعليق الخلايا في صفيحة مكونة من 6 آبار ونقلها كما تم في الخطوتين 5.9 و 5.10.
11. أضف وسائط جديدة عند الحاجة. في هذه الخطوة ، قم بتجميد الخلايا عند 10 - 30 مليون / مل في 90٪ مصل ربلة الساق الجنينية و 10٪ DMSO. إذا كانت هناك حاجة إلى كميات أكبر من الخلايا ، فاستمر في توسيع المستنسخة في ألواح سطحية أكبر.

فئة

6. ELISA للكشف عن الأجسام المضادة IgG

1. قم بتوزيع 50 ميكرولتر/بئر في صفيحة ELISA من الجسم المضاد F(ab)₂ Fc المضاد للإنسان المخفف 1 200 في مخزن الطلاء. يحتوي المخزن المؤقت للطلاء على 50 ملي مولار من كربونات الصوديوم (Na₂CO₃) درجة الحموضة 9.6.
2. أغلق الألواح بملصق بلاستيكي ، واحتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، بدلا من ذلك ، احتضن عند 4 درجات مئوية O / N.
3. اغسل كل بئر 6 مرات ب 200 ميكرولتر من محلول الغسيل. يحتوي المخزن المؤقت للغسيل على 0.05٪ Tween-20 في 1 × PBS. لا تلمس أو تخدش سطح البئر حيث يرتبط الجسم المضاد.
4. كتلة مع مانع عازلة ، 100 ميكرولتر / بئر. يحتوي المخزن المؤقت المانع على 4٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم في PBS. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
5. لا تغسل. تخلص من المخزن المؤقت المانع وصفع اللوحة 3 مرات رأسا على عقب على منشفة ورقية لإزالة السائل المتبقي.
6. احتضان المواد الطفية والمعايير المستنسخة.
   1. في الاختبار الأول ، تم تخفيف المواد الطافية المستنسخة التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.6 أو 5.7 1/3 في RPMI. للمعايير المخففة مع RPMI متوسط حل IgG البشري للحصول على: 1,000 نانوغرام / مل ، 500 نانوغرام / مل ، 250 نانوغرام / مل ، 125 نانوغرام / مل ، 62.5 نانوغرام / مل ، 31.25 نانوغرام / مل ، 15.6 نانوغرام / مل وفارغة. استخدم 50 ميكرولتر / بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بتحليل المزيد من التخفيفات للطافي المستنسخ لاختبار تقارب الجسم المضاد ، مثل 1/10 أو 1/100.
7. اغسل كما هو الحال في الخطوة 6.3.
8. استخدم 50 ميكرولتر / بئر من الماعز F (ab) 2 IgG Fc بيروكسيداز مضاد للإنسان مخفف 1: 20،000 في مخزن الحضانة. يحتوي مخزن الحضانة على 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 0.02٪ توين 20 في 1x PBS. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
9. اغسل كما هو الحال في الخطوة 6.3.
10. أضف 100 ميكرولتر / محلول ركيزة بئر يحتوي على 0.1٪ 3،3 '، 5،5 '-Tetramethylbenzidine (TMB). احتضن لمدة 10 دقائق حتى يتشكل لون أزرق مستقر في الآبار. انتبه; لا تنتظر طويلا!
11. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من 2 M من حمض الكبريتيك (H₂SO₄). قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر ، في غضون 30 دقيقة بعد إيقاف التفاعل.
    ملاحظة: سيتم اعتبار جميع المواد الطافية للنسخ المستنسخة مع 3 انحرافات معيارية على الفراغ إيجابية للأجسام المضادة البشرية IgG. لتأكيد الاستنساخ الإيجابي ، يجب تكرار ELISA ثلاث مرات على الأقل في مواد طافية مختلفة من نفس الاستنساخ. يوصى أيضا بتجاهل إمكانية التفاعل المتقاطع غير المحدد للتأكد من عدم وجود إشارة عند احتضان المواد الطافية في آبار غير مطلية ولكن مسدودة. في هذه الخطوة ، يمكن إجراء اختبار الكشف للكشف عن خصوصية المستضدات للأجسام المضادة ذات الأهمية قبل الانتقال إلى القسم 7.

< p class = "jove_title" >7. عزل الحمض النووي الريبي وتوليف الحمض النووي التكميلي الأول (cDNA) لاستنساخ IgG المنتج

1. بمجرد تأكيد إنتاج IgG بواسطة ELISA ، استخرج الحمض النووي الريبي للاستنساخ.
2. لاستخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا التي تنمو في الخطوتين 5.7 أو 5.9 ، استخدم مجموعة تخليق الحمض النووي (كدنا) المباشرة للخلايا المرتفعة III ، والتي تسمح بالحصول على الحمض النووي من 10,000 خلية إلى خلية واحدة.
3. لاستخراج الحمض النووي الريبي من كميات أكبر من الخلايا ، أو من الحبيبات المخزنة في الخطوة 5.11 ، استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي عالية النقاء. يمكن أن تكون أنظمة استخراج الحمض النووي الريبي الأخرى مناسبة أيضا في هذه الخطوة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
4. بالنسبة لأرقام الخلايا بين 1 × 10⁶ و 1 × 10⁴ ، استخدم نظام النسخ العكسي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. يمكن أيضا استخدام أنظمة أخرى لتخليق الحبلا الأول (كدنا
).

< p class = "jove_title" >8. 1^st و 2^nd PCR لتضخيم السلاسل الثقيلة والخفيفة لاستنساخ الخلايا البائية المنتجة ل IgG

1. باستخدام (كدنا) لاستنساخ الخلية ، التي تم الحصول عليها في الخطوتين 5.6 و 5.7 والإيجابية في IgG ELISA في الخطوة 6 ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال المدرجة في الجدول 1.
2. قم بإعداد PCRs مستقلة لكل سلسلة IgG الثقيلة والكاب واللامدا. اصنع محلول مخزون باستخدام بادئات أمامية وعكسية بتركيزات متساوية. أضفها إلى التفاعل عند التركيز النهائي 0.4 ميكرومتر.
3. استخدم 1 ميكرولتر من تخليق (كدنا) لإجراء 1^ST PCR. هنا ، قم بإجراء تفاعلات 20 ميكرولتر باستخدام تعليمات الشركة المصنعة ل Takara Taq. بدلا من ذلك ، استخدم البوليميرات الأخرى.
4. ضع 1 ش PCR في ظل ظروف الدورة التالية: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ (50 دورة من: 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق ؛ اتركه يبرد عند 4 درجات مئوية ، وقم بتضمين فراغ في التفاعل ، للكشف عن التلوث المحتمل.
5. تحضير 1x TBE (89 ملي مولار تريس بورات و 2 ملي EDTA). في حجم 100 مل من 1x TBE أضف 1 غرام من الاغاروز (1٪ هلام الاغاروز). سخني المحلول في الميكروويف لمدة 1 دقيقة تقريبا ، حتى يذوب الاغاروز. ثم أضف 4 ميكرولتر من 10 مجم / مل من بروميد الإيثيديوم (أو صبغة الحمض النووي المكافئة) واخلطها.
   1. صب المحتوى في صينية وانتظر حتى يتبلمر. قم بتشغيل 5 ميكرولتر من مزيج PCR في الجل لتصور الأربطة. يجب أن تكون شظايا السلسلة الثقيلة حوالي 400-550 نقطة أساس، بينما يجب أن تكون السلسلة الخفيفة حوالي 300-400 نقطة أساس. إذا لم يتم الكشف عن العصابات ، فانتقل أيضا إلى 2^دوم PCR.
6. استخدم 1 ميكرولتر من أول مزيج PCR لإجراء 2nd PCR. استخدم نفس الكواشف الموجودة في الخطوة 8.2 ولكن باستخدام المزيج المناسب من البادئات (انظر الجدول 1). بالنسبة^لتفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني ، استخدم الشروط التالية: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ (50 دورة من: 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 56.5 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 55 ثانية) ؛ 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق ؛ اتركه يبرد عند 4 درجات مئوية. قم بتضمين فراغ في التفاعل ، للكشف عن تلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل.
7. تحضير جل الاغاروز كما هو موضح في 8.5. قم بتشغيل الجل لتصور منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل كما في 8.5.1 استخدم التضخيمات التي تحتوي على شظايا الحجم المناسب للاستنساخ في الخطوة 9 وأنتج الأجسام المضادة في الخطوة 10.
8. تسلسل الحمض النووي ، باستخدام تفاعل 10 ميكرولتر يحتوي على: 100 نانوغرام من تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني ، 0.2 ميكرومتر من مزيج التمهيدي أو التمهيدي ، 1 ميكرولتر من المنهي و 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت. قم بإجراء تفاعل التسلسل في ظل هذه الظروف: (25 دورة من: 96 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ 50 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ؛ و 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق) ؛ 60 درجة مئوية لمدة 7 دقائق ؛ اتركه يبرد عند 4 درجات مئوية.
قم
9. بتنقية تفاعلات التسلسل باستخدام أعمدة microspin G50 باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتقييم تسلسل الربط في محلل التسلسل التلقائي كما هو موضح من قبل. يجب أن تكون مخططات الكهربية نظيفة وتتوافق مع تسلسل الغلوبولين المناعي الواحد. < / > ملاحظة: إذا أظهرت منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل تسلسلات الغلوبولين المناعي غير واضحة أو مختلطة ، فيرجى التفكير في استنساخها باستخدام نظام TopoTA ، للحصول على تسلسلات معزولة ثم الانتقال إلى الخطوة 9.

< p class = "jove_title" >9. استنساخ وتسلسل السلاسل الثقيلة والخفيفة لاستنساخ IgG المنتجة

1. تحضير 1 ميكروغرام من الحمض النووي للنواقل pFUSE2ss-CLIg-hk و pFUSE2ss-CLIg-hl2 و pFUSEss-CHIg-hG1.
2. استيعاب هذه النواقل بإنزيمات التقييد المناسبة. أستذب EcoRI وBsiWI ل pFUSE2ss-CLIg-hk وEcoRI وAvrII ل pFUSE2ss-CLIg-hl2 وEcoRI وNheI ل pFUSEss-CHIg-hG1. استخدم 3 وحدات من كل إنزيم تقييد ل 1 ميكروغرام من الحمض النووي للناقل.
   1. قم بهضمه باستخدام إنزيم واحد وتنقية المنتج المهضوم باستخدام مجموعة تنقية PCR. هضم بالإنزيم الثاني وقم بتنقية باستخدام مجموعة استخراج الجل (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). قطع جزء الاهتمام من هلام الاغاروز. تحضير جل الاغاروز كما في الخطوة 8.5.
3. استيعاب منتجات 2nd PCR من إنتاج IgG استنساخ: EcoRI و BsiWI لتضخيم سلسلة kappa ، و EcoRI و AvrII لتضخيم سلسلة lambda ، و EcoRI و NheI لتضخيم السلسلة الثقيلة. قم بهضمه باستخدام إنزيم واحد وتنقية المنتج المهضوم باستخدام مجموعة تنقية PCR. قم بهضمه باستخدام الإنزيم الثاني وتنقية المنتج المهضوم باستخدام مجموعة تنقية PCR. استخدم نفس وحدات الإنزيمات وكمية الحمض النووي كما في الخطوة 9.2.
4. قم بربط شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل داخل النواقل باستخدام T4 DNA ligase 16 °C O / N باتباع توصيات الشركة المصنعة. يجب أن تكون النسبة المستخدمة 1: 2 (المتجه: إدراج).
5. استخدم 1 ميكرولتر من الربط لتحويل بكتيريا DH5α. اتبع شروط الشركة المصنعة DH5α للتحول. انشر البكتيريا في ألواح بلاستيسيدين أو زيوسين ، اعتمادا على نوع الناقل المستخدم. احتضان الألواح O / N عند 37 درجة مئوية.
6. قم بزراعة مستعمرات مفردة ، واستخرج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات التحضير المصغرة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. استخدم لزراعة مستعمرة واحدة واستخراج الحمض النووي ، توصيات الشركة المصنعة من مجموعة أدوات الحمض النووي المصغرة. قم بتحليلها عن طريق الهضم باستخدام الإنزيمات المستخدمة في تحضير النواقل والإدخالات كما في الخطوتين 9.2 و 9.3.
7. تسلسل الحمض النووي باستخدام 100 نانوغرام من المتجه كما هو الحال في الخطوتين 8.8 و 8.9.

< p class = "jove_title" >10. إنتاج الأجسام المضادة في خلايا HEK

1. تنمو خلايا HEK في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ ، و 1٪ جلوكوز L ، و 1٪ بنسلين / ستربتافيدين (DMEM +) إلى التقاء 75٪ في صفيحة زراعة الخلايا 150 مم. أداء في غطاء محرك السيارة الخطوة 10.1 إلى 10.7.
2. قبل التعدي ، استبدل المتوسط إلى المتوسط كما كان من قبل ولكن بدون مصل ربلة الساق الجنينية.
3. لكل تعداء ثقيل وخفيف السلسلة ، قم بإعداد مزيج تعداء مع 2.5 مل من DMEM (بدون مصل) ، و 9 ميكروغرام من الناقل مع السلسلة الثقيلة ، و 6 ميكروغرام من المتجه مع السلسلة الخفيفة ، و 100 ميكرولتر من محلول بولي إيثيلينيمين (PEI) (من مخزون 1 ميكروغرام / ميكرولتر). احتضن في RT لمدة 15 دقيقة.
4. أضف برفق 2.5 مل من مزيج التعداء المحضر في الخطوة 10.3 إلى خلايا HEK في اللوحة. هز اللوحة لتوزيعها بشكل متجانس.
5. احتضان الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
6. قم بتغيير متوسط المزرعة إلى متوسط بدون مصل ربلة الساق الجنينية.
7. اجمع الوسط من الأطباق بعد 4 أيام. < / > ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة في الوسائط لتوصيف تفاعلها في المختبر وفي الجسم الحي.

< p class = "jove_title" >الجدول 1. الاشعال المستخدمة.

1^st primers PCR إلى الأمام (5'-3') عكس (3'-5') IgG 5 ′ L-VH 1 ACAGGTGCCCCCCCAGGTGCAG 3 ′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC 5 ′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG 5 ′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGGCAG 5 ′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG κ 5 ′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG 3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTGCTcttgctca 5′ L Vκ 3 CTCTTCCCTGCTACTCTGGCTCCCAG 3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT 5 ′ لتر Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG 5 ′ عموم Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG λ 5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG 3 ′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG 5 ′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG 5 ′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG 5 ′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG 5 ′ L Vλ 6 GTTCTTGGCCAATTTTTTATGCTG 5 ′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGGTG 5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCAGACTGTGGTG 2^nd بادئات PCR إلى الأمام (5'-3') عكس (3'-5') IgH 5 ′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG
TGCAG 3 ′ NheI JH 1،2،4،5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGGGGGT
GACCAG 5 ′ EcoRI VH1 إلى 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
جي جي سي اي جي 3 ′ NheI JH 3 CTGCTAGCTGAGAGGGTGA
CCATTG 5 ′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
GTGGAG 3 ′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGAGGGTG
ACCGTG 5 ′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCT
GTTGGAG 5 ′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GCAGGAG 5 ′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC
AGCAGTG 5 ′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT
GGTGCAG 5 ′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT
GGTACAG 5 ′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GGTGGAG 5 ′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT
GGTGGAG 5 ′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT
GCAGGAG 5 ′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT
GCAGCAG κ 5 ′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA
CCCAGTC 3 ′ BsiWI Jκ 1 إلى 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC 5 ′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC
CCAGTCT 3 ′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG
CTTGGTC 5 ′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA
CCCAGTC 3 ′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT
TTGGTC 5 ′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGA
CCCAGAC 5 ′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTG
ACTCAGTC 5 ′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTGT
CTCAGTC 5 ′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG
أكاكاجت 5 ′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGATG
ACGCAGTC 5 ′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAATTGTGTGTga
CGCAGTCT 5 ′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG
ACCCAGTC λ 5 ′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTGTGTGCT
GACKCAG 3 ′ AvrII Jλ 1 إلى 3 CTGGTTACCTAGGAGGGGGGTSACCT
TGGTCCC 5 ′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC
TGACTCAG 3 ′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC
TGGGTTCC 5 ′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC
TGACWCAG 3 ′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC
TCGGTCCC 5 ′ EcoR1 Vλ 4 إلى 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG
CTGACTCA 3 ′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT
GGGTGCC 5 ′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAATTTTTTATGC
TGACTCAG 3 ′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC
TTGGTCCAT 5 ′ EcoR1 Vλ 7 إلى 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG
GTGACYCAG

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات هيستوباك -1077 سيجما ألدريتش هاتف: 10771 محلول يحتوي على عديد السكروز ودياتريزوات الصوديوم فارز الخلايا FACSAria II BD Biosciences 96 لوحة بئر صغيرة على شكل حرف U كوستار 3799 معهد روزويل بارك التذكاري المتقدم (RPMI) 1640 متوسط جيبكو ، لايف تكنولوجيز هاتف: 12633-020 30٪ حجم / حجم المادة الطافية المحتوية على EBV لخط الخلايا B95-8 ATCC [رل-1612] 3.4 × 108 نسخة/مل سي بي جي 2006 إنفيفوجين ODN 7909 خلايا Wi38 سيجما ألدريتش 90020107 إنترلوكين -2 روش 10799068001 لوحات ELISA Greiner Bio-One, ميكرولون 655092 AffiniPure F (ab') 2 جزء الماعز المضاد للإنسان IgG ، جزء Fcγ خاص (غير مترافق) جاكسون للأبحاث المناعية 109-006-008 4٪ حليب جاف خالي الدسم (مانع النشاف الصف) بيوراد 170-6404 IgG البشري سيغما أنا 2511 الغلوبولين المناعي المنقى HUMAN IgG ، 5.6 مجم / مل Goat F (ab) 2 IgG Fcγ المضاد للإنسان (مقترن بالبيروكسيداز (PO)) جاكسون للأبحاث المناعية 109-036-008 قارئ ELISA (Perkin Elmer 2030) بيركين إلمر 2030-0050 AffiniPure Rabbit المترافق مع البيروكسيديز IgM المضاد للإنسان ، Fc5μ جاكسون للأبحاث المناعية 309-035-095 نظام تخليق الحمض النووي (كدنا) المباشر للخلايا SuperScript III إنفيتروجين 18080-200 نظام GeneAm PCR للأنظمة الحيوية التطبيقية (ABI) 2700 الأنظمة الحيوية التطبيقية طقم عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء روش 11828665001 طقم نظام النسخ العكسي بروميجا أ 3500 المؤتلف Taq DNA Polymerase تاكارة R001A بادئات (2 ميكرولتر) سيغما أغاروز فائق النقاء إنفيتروجين 16500-500 سلم 100 نقطة أساس إنفيتروجين 15628-019 الكمية الأولى 4.5.2 (Gel Doc 2000) بيوراد 170-8100 طقم تنقية QIAquick PCR كياجين هاتف 28106 طقم تسلسل دورة BigDye Terminator v3.1 الأنظمة الحيوية التطبيقية 4337455 لوحة تفاعل 0.1 مل (MicroAMP Optical 96-well) الأنظمة الحيوية التطبيقية 4346906 المحلل الجيني ABI300 الأنظمة الحيوية التطبيقية 4346906 DH5α الخلايا المختصة (الإشريكية القولونية) إنفيتروجين 18263-012 pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 نقطة أساس) إنفيفوجين PFUSESS-HCHG1 pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 نقطة أساس) إنفيفوجين PFUSESS-HCHG4 pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 نقطة أساس) إنفيفوجين pfuse2ss-hclk pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 نقطة أساس) إنفيفوجين بفيوز 2 اس إس - HCL2 SOC متوسط إنفيتروجين هاتف: 15544-034 وسط أجار قائم على LB مكمل ب Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) إنفيفوجين فاس - زنك - س وسط سائل قائم على مرق رائع (TB) مكمل ب Zeocin (Fast-Media Zeo TB) إنفيفوجين فاس - الزنك - ل طقم DNA Miniprep أوميغا بيو تكنولوجي د6942-02 Nanodrop (مقياس الطيف الضوئي ND1000) نانودروب وسط أجار قائم على LB مكمل ب Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) إنفيفوجين فاس - BL-S وسط سائل قائم على مرق رائع (TB) مكمل ب Blasticidin (Fast-Media Blast TB) إنفيفوجين فاس - BL-L إيكوري نيو إنجلاند بيولابيس R0101S 20,000 وحدة / مل ، في 10x NEBuffer EcoRI نهي نيو إنجلاند بيولابيس R0131S 10,000 وحدة / مل ، في 10x NEBuffer 2.1 2-سجل سلم الحمض النووي نيو إنجلاند بيولابيس N3200S 0.1-10.0 كيلو بايت ، 1,000 ميكروغرام / مل إكس ماي آي نيو إنجلاند بيولابيس R0180S 10,000 وحدة / مل ، في 10x CutSmart Buffer بي إس آي وي نيو إنجلاند بيولابيس R0553S 10,000 وحدة / مل ، في 10x NEBuffer 3.1 أفري نيو إنجلاند بيولابيس R0174S 5,000 وحدة / مل ، في 10x CutSmart Buffer FastAP الفوسفاتيز القلوي الحساس للحرارة الترمو: العلمية إف 0651 1 وحدة / ميكرولتر ، في 10x FastAP Buffer DH5α الخلايا المختصة إنفيتروجين 18263-012 PE ماوس مضاد للإنسان IgG BD Pharmingen 555787 مضاد ل CD22 ، PerCP-Cy5.5 ، استنساخ: HIB22 فيشر علمي BDB563942 QIAprep Spin Miniprep Kit كياجين هاتف: 27106 BigDye المنهي v3.1 الأنظمة الحيوية التطبيقية 4337455