تقنية الورم الهجين لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد ميتالوببتيداز

الملخص

المصدر: Xia ، P. ، et al. إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف أمينوببتيداز N في الظهارة المخاطية المعوية للخنازير. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو فحصا لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد أمينوببتيداز N (APN) ، وهو معدن بببتيداز مرتبط بالغشاء ، باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية. عند تحصين الفأر باستخدام APN ، يتم حصاد خلايا الطحال ودمجها مع خلايا الورم النقوي الخالدة لإنتاج الأورام الهجينة. ثم يتم اختيار الأورام الهجينة وتكاثرها باستخدام وسط HAT (هيبوكسانثين-أمينوبترين-ثيميدين) لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة خاصة بحواتم APN المختلفة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع إجراءات النموذج الحيواني من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحصين

تحت
1. الجلد (s.c) حقن إناث الفئران BALB / c ، 6-8 أسابيع من العمر ، مع 50 ميكروغرام من بروتين APN أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، تحكم سلبي) ممزوج بالمواد المساعدة مرة كل أسبوعين. استخدم مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على البكتيريا الفطرية المقتولة بالحرارة للتحصين الأولي ، ومساعد فرويند غير المكتمل للتطعيمات المعززة. امزج كميات متساوية من بروتين APN (أو PBS) ومساعد فرويند أو مساعد فرويند غير المكتمل ، على التوالي.
2. الكشف عن عيارات الأجسام المضادة ضد APN في مصل هذه الفئران عن طريق مقايسة الممتز المناعي غير المباشر المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام صفيحة ميكروتيتر مطلية ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (الرقم الهيدروجيني 9.6).

فئة

2. تقنية الورم الهجين لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد APN

1. داخل الصفاق (IP) حقن 100 ميكروغرام من بروتين APN في الفئران المختارة لتعزيز المستضد النهائي.
2. بعد ثلاثة أيام ، قتل الفئران باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم ، V / v ، داخل الصفاق) وخلع عنق الرحم.
3. اجمع الطحال واغسله ب DMEM مرتين لإزالة الدم والخلايا الدهنية. قم بتصفية معلق خلايا الطحال باستخدام شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة لإزالة بقايا الأنسجة ، وحصاد خلايا الطحال باستخدام الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) لإزالة غشاء الطحال.
4. خلايا الورم النخاعي لفأر البذور SP2 / 0 في قارورة 2 مقاس 25 سم تحتوي على 5 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 6٪ مصل بقري جنين (FBS) ومزرعة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ جو ثاني أكسيد الكربون₂ للحفاظ على بقاء الخلية. بعد 5-6 أيام من الثقافة ، تصل الخلايا إلى 80٪ -90٪ من التقاء بعد الإنعاش وهي في مرحلة سجل النمو. تحت المجهر ، تكون الخلايا مستديرة ومشرقة وواضحة.
5. قبل يوم واحد من التهجين ، اجمع البلاعم من التجاويف البريتونية للفئران وفقا لطريقة منشورة مسبقا.
6. ضامة بريتونية البذور بكثافة 0.1-0.2 × 10⁵ / مل في ألواح 96 بئرا ، تحتوي كل بئر على 100 ميكرولتر من وسط HAT (DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1x HAT) ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ جو مرطب بين عشية وضحاها.
7. للتهجين، قم بشفط خلايا SP2/0 برفق باستخدام ماصة من 8-10 زجاجات، وعلقها في 10 مل من وسط DMEM الخالي من المصل. اغسل الخلايا بجهاز طرد مركزي جديد من DMEM (1500 × جم ، 10 دقائق) مرتين ، ثم أعد تعليقه في 10 مل من DMEM.
8. امزج خلايا الطحال المحددة كميا مع خلايا SP2 / 0 بنسبة 10: 1 وانقلها إلى أنابيب سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) وتخلص من المادة الطافية. اجمع كريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب واضغط براحة اليد لفك الكريات قبل التهجين.
9. أضف 1 مل من البولي إيثيلين جلايكول 1500 (PEG 1500) ، الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، بالتنقيط باستخدام قطارة إلى حبيبات الخلية المفككة خلال الفترة الزمنية التي تبلغ 45 ثانية أثناء تدوير قاع الأنبوب برفق.
10. أضف ببطء 1 مل من DMEM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الخليط أعلاه على مدى 90 ثانية ، متبوعا ب 30 مل أخرى من DMEM الطازج. ضع أنبوب الانصهار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
11. بعد الحضانة في الحمام الدافئ ، احصد الخلايا وأعد تعليقها في وسط HAT. ثم استزراع في صفيحة 96 بئرا ملقحة بالضامة الصفاقية.
12. بعد خمسة أيام ، أضف 100 ميكرولتر من وسط HAT الطازج إلى كل بئر ، واحتضن الطبق لمدة 5 أيام إضافية ، وبعد ذلك استبدل الوسط بوسط HT (DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1x HT Supplement).
13. استخدم صفيحة ميكروتيتر مطلية ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (الرقم الهيدروجيني 9.6) لتحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في الورم الطافي الهجين باستخدام مقايسة ELISA.
    1. عندما يتحول الوسط الموجود في آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى اللون الأصفر (بسبب نمو الخلايا وإطلاق المستقلب ، ينخفض الرقم الهيدروجيني في الوسط إلى 6.8 ، ويتحول لون الفينول الأحمر من الفوشيه إلى الأصفر) أو لوحظت مجموعات الخلايا ، احصل على 100 ميكرولتر من المادة الطافية من الآبار المختارة وأضفها إلى آبار لوحة ELISA المطلية. استخدم قارئ الألواح الدقيقة لقياس قيم OD₄₅₀.
    2. استخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد APN ومصل الفأر غير المصاب كتحكم إيجابي وسلبي ، على التوالي ، واستخدم PBS كتحكم فارغ. في هذه الدراسة ، تم التعرف على نسبة OD₄₅₀ للعينة إلى المراقبة السلبية (P / N) ≥ 2.1 كمعيار انتقاء إيجابي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أكمل مساعد فرويند سيجما ألدريتش F5881 تحصين DMEM جيبكو 11965092 زراعة الخلايا DMEM-F12 جيبكو 12634010 زراعة الخلايا مجموعة عد الخلايا المحسنة -8 بيوتيم بيوتكنولوجي سي 0042 قياس صلاحية الخلية وحيويتها مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10091 زراعة الخلايا المضادات الحيوية الانتقائية Geneticin™ جيبكو 11811098 مضاد حيوي انتقائي مكمل HAT (50X) جيبكو 21060017 اختيار الخلية مكمل HT (100X) جيبكو 11067030 اختيار الخلية مساعد فرويند غير مكتمل سيجما ألدريتش F5506 تحصين قارئ اللوحة الدقيقة بيوتك صندوق 998 تحليل ELISA بولي إيثيلين جلايكول 1500 تشخيص روش 10783641001 اندماج الخلية 96 بئر صفيحة كورنينج 3599 [إ] زراعة الخلايا