طريقة لإنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة ضد الميتالوببتيداز

الملخص

المصدر: Xia ، P. et al. ، إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف Aminopeptidase N في الظهارة المخاطية المعوية الخنازيرية.J. Vis. Exp.(2021)

يوضح هذا الفيديو إجراء لإنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة ضد الميتالوببتيداز. يتم نقل البلازميدات المؤتلفة التي تحمل جينات الجسم المضاد والبروتين الفلوري الأخضر ومقاومة المضادات الحيوية إلى الخلايا الظهارية مع الليبوفيكتامين. يتم اختيار الخلايا المنقولة وزراعتها لتوليد أجسام مضادة مؤتلفة.

البروتوكول

فئة

1. تحضير مستضد بروتين أمينوببتيداز N (APN)

ملاحظة: تم إنشاء سلالة pET28a (+) -APN-BL21 (DE3) والخلايا المعبر عنها بثبات pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 في دراسة سابقة.

1. استعادة البكتيريا من مخزون الجلسرين المجمد وخطها على ألواح Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (Km ⁺) لعزل مستعمرة واحدة.
2. حدد مستعمرة واحدة من الصفيحة المخططة حديثا ، واستزراعها في 4 مل من وسط LB (10 جم / لتر من التربتون ، و 10 جم / لتر من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ) و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، درجة الحموضة 7.2) مع Km ⁺ (50 ميكروغرام / مل) ، واتركها لتنمو طوال الليل (12-16 ساعة) مع التحريك (178 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
3. خفف البكتيريا المحضرة في 1: 100 في مرق Km ⁺ LB الطازج واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 2-3 ساعات حتى يصل OD₆₀₀ إلى 0.4-0.6.
4. أضف الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى الوسط إلى تركيز نهائي يبلغ 0.4 ملي مولار ، واحتضان المزارع لمدة 10 ساعات إضافية عند 16 درجة مئوية.
5. وبالتالي ، أجهزة الطرد المركزي وحصاد البكتيريا باستخدام تحريض IPTG (10,000 × جم ، 4 درجات مئوية 15 دقيقة).
6. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت LEW (التحلل / التوازن / الغسيل) (50 ملي مولار أحادي القاعدة من فوسفات الصوديوم اللامائي (NaH₂PO₄) و 300 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.0) الذي يحتوي على 1 مجم / مل من الليزوزيم. حرك التعليق البكتيري لمدة 30 دقيقة على الجليد والصوتنة تماما (15 ثانية نبضة و 20 ثانية ، 15 دقيقة) باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية.
7. جهاز الطرد المركزي تحلل الخلية الخام عند 4 درجات مئوية و 10,000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. انقل المادة الطافية إلى عمود متوازن مسبقا واحتضانها قبل 1-2 دقيقة من تصريف الجاذبية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
8. اغسل العمود باستخدام 20 مل من المخزن المؤقت LEW وصفيه باستخدام الجاذبية. قم بإزالة بروتين APN الموسوم بالهيستيدين باستخدام 9 مل من محلول الشطف (50 ملي مولار NaH₂PO₄ و 300 ملي كلوريد الصوديوم و 250 ملي مولار إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0) وتجميعها في أنابيب غسيل الكلى.
غسيل
9. محلول البروتين طوال الليل عند 4 درجات مئوية في بيكربونات الصوديوم كربونات الصوديوم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 135 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.7 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 2 ملي مولار هيدروهيدرات_{الصوديوم 2}PO₄ ، و 10 ملي مولار دوديكاهيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ، درجة الحموضة 7.2).
10. قم بالتحليل باستخدام هلام SDS-PAGE بنسبة 12.0٪ والنشاف الغربي لتقييم نقاء بروتين APN.
    1. قم بتحميل 5 ميكروغرام من البروتين في كل بئر من الجل واتركه يعمل عند 110 فولت لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك ، انقل البروتين إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) لمدة 50 دقيقة عند 15 فولت. حدد تركيز البروتين المنقى باستخدام مقايسة حمض البيسنشونيك (BCA).

2. تحصين

1. تحت الجلد (s.c) حقن إناث الفئران BALB / c ، 6-8 أسابيع من العمر ، مع 50 ميكروغرام من بروتين APN أو PBS (التحكم السلبي) الممزوج بالمواد المساعدة مرة كل أسبوعين. استخدم مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على البكتيريا الفطرية المقتولة بالحرارة للتحصين الأولي ، ومساعد فرويند غير المكتمل للتطعيمات المعززة. امزج كميات متساوية من بروتين APN (أو PBS) ومساعد فرويند أو مساعد فرويند غير المكتمل ، على التوالي.
2. الكشف عن عيارات الأجسام المضادة ضد APN في مصل هذه الفئران عن طريق مقايسة الممتز المناعي غير المباشر المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام صفيحة ميكروتيتر مطلية ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (الرقم الهيدروجيني 9.6).

3. تقنية الورم الهجين لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد APN

1. داخل الصفاق (IP) حقن 100 ميكروغرام من بروتين APN في الفئران المختارة لتعزيز المستضد النهائي.
2. بعد ثلاثة أيام ، قتل الفئران باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم ، V / v ، داخل الصفاق) وخلع عنق الرحم.
3. اجمع الطحال واغسله باستخدام Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مرتين لإزالة الدم والخلايا الدهنية. قم بتصفية معلق خلايا الطحال باستخدام شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة لإزالة بقايا الأنسجة ، وحصاد خلايا الطحال باستخدام الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) لإزالة غشاء الطحال.
4. خلايا الورم النخاعي للفأر SP2 / 0 في قارورة 25 سم² تحتوي على 5 مل من DMEM مكملة بمصل بقري جنين 6٪ (FBS) ومزرعة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) للحفاظ على بقاء الخلية. بعد 5-6 أيام من الثقافة ، تصل الخلايا إلى 80٪ -90٪ من التقاء بعد الإنعاش وهي في مرحلة سجل النمو. تحت المجهر ، تكون الخلايا مستديرة ومشرقة وواضحة.
5. قبل يوم واحد من التهجين ، اجمع البلاعم من التجاويف البريتونية للفئران وفقا لطريقة منشورة مسبقا.
6. ضامة بريتونية البذور بكثافة 0.1-0.2 × 10⁵ / مل في 96 بئر ، تحتوي كل بئر على 100 ميكرولتر من وسط هيبوكسانثين - أمينوبترين - ثيميدين (HAT) (DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1x HAT) ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ جو مرطب بين عشية وضحاها.
7. للتهجين، قم بشفط خلايا SP2/0 برفق باستخدام ماصة من 8-10 زجاجات وعلقها في 10 مل من وسط DMEM الخالي من المصل. اغسل الخلايا بجهاز طرد مركزي جديد من DMEM (1500 × جم ، 10 دقائق) مرتين ، ثم أعد تعليقه في 10 مل من DMEM.
8. امزج خلايا الطحال المحددة كميا مع خلايا SP2 / 0 بنسبة 10: 1 وانقلها إلى أنابيب سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) وتخلص من المادة الطافية. اجمع كريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب واضغط براحة اليد لفك الكريات قبل التهجين.
9. أضف 1 مل من البولي إيثيلين جلايكول 1500 (PEG 1500) ، الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، بالتنقيط باستخدام قطارة إلى حبيبات الخلية المفككة خلال الفترة الزمنية التي تبلغ 45 ثانية أثناء تدوير قاع الأنبوب برفق.
10. أضف ببطء 1 مل من DMEM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الخليط أعلاه على مدى 90 ثانية ، متبوعا ب 30 مل أخرى من DMEM الطازج. ضع أنبوب الانصهار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
11. بعد الحضانة في الحمام الدافئ ، احصد الخلايا وأعد تعليقها في وسط HAT. ثم استزراع في صفيحة 96 بئرا ملقحة بالضامة الصفاقية.
12. بعد خمسة أيام ، أضف 100 ميكرولتر من وسط HAT الطازج إلى كل بئر ، واحتضن الطبق لمدة 5 أيام إضافية ، وبعد ذلك استبدل الوسط بوسط HT (DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1x HT Supplement).
13. استخدم صفيحة ميكروتيتر مطلية ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (الرقم الهيدروجيني 9.6) لتحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في الورم الطافي الهجين باستخدام مقايسة ELISA.
    1. عندما يتحول الوسط الموجود في آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى اللون الأصفر (بسبب نمو الخلايا وإطلاق المستقلب ، ينخفض الرقم الهيدروجيني في الوسط إلى 6.8 ، ويتحول لون الفينول الأحمر من الفوشيه إلى الأصفر) أو لوحظت مجموعات الخلايا ، احصل على 100 ميكرولتر من المادة الطافية من الآبار المختارة وأضفها إلى آبار لوحة ELISA المطلية. استخدم قارئ الألواح الدقيقة لقياس قيم الكثافة البصرية 450 (OD450).
    2. استخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد APN ومصل الفأر غير المصاب كتحكم إيجابي وسلبي ، على التوالي ، واستخدم PBS كتحكم فارغ. في هذه الدراسة ، تم التعرف على نسبة OD450 للعينة إلى المراقبة السلبية (P / N) ≥ 2.1 كمعيار اختيار إيجابي.
14. بعد ثلاث جولات اختيار إيجابية متتالية ، حدد الورم الهجين الذي يظهر استجابة مصلية متزايدة ضد بروتين APN لمقايسة تخفيف محدودة.
    1. تحضير البلاعم البريتونية والبذور في ألواح 96 بئرا كما هو موضح سابقا.
    2. قم بتعليق خلايا الورم الهجين في وسط HT بمعدل 0.5-2 خلية لكل بئر وزراعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂. كرر هذه الخطوة ثلاث أو أربع مرات حتى يصل المعدل الإيجابي المشار إليه بواسطة المقايسة المناعية ELISA إلى 100٪.
15. تحت ضغط التجميد والذوبان المستمر ، حدد خلايا الورم الهجين الإيجابي القادرة على إفراز الأجسام المضادة ل APN بثبات والتكاثر بشكل طبيعي.
    1. يجب تطبيق حقنة IPP واحدة بمقدار 0.3 مل من البريستان لكل فأر (8-10 أسابيع). بعد 10 أيام من تلقي البكر ، حقن كل فأر ب 2-5 × 10⁵ خلايا ورم هجين في 0.5 مل من PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2).
    2. اجمع السائل البريتوني بعناية من التجويف البريتوني لهذه الفئران بعد 8 إلى 10 أيام من الحقن.
    3. احصد المواد الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 15 دقيقة وتنقية الأجسام المضادة في المواد الطافية باستخدام 33٪ كبريتات الأمونيوم المشبعة [(NH₄) ₂SO₄] وهطول البروتين أ الاغاروز.

< p class = "jove_title" >4. توصيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) ضد بروتين APN

1. تحديد النوع الفرعي للجلوبولين المناعي من mAbs التي تم جمعها باستخدام نظام التنميط النسبي SBA-HRP. استخدم SDS-PAGE والنشاف الغربي لتقييم نقاء mAb وخصوصيته.
2. تحليل خصوصية حاتمة mAb مقابل بروتين APN باستخدام ELISA. قيمة الإضافة (AV) هي نسبة OD_{mAbs (a + b)} إلى (OD_mAbs-a + OD_mAbs-b) ، والتي تستخدم لتقييم ما إذا كانت mAbs تتعرف على نفس موقع المستضد. يمثل OD_mAbs-a و OD_mAbs-b قيم OD450 للأجسام المضادة وحيدة النسيلة المختلفة ضد APN وحده ، ويمثل OD_{mAbs (a + b)} قيم OD450 لمزيج 1: 1 من اثنين من mAbs ضد APN.
   1. قم بتقييم كل عينة على الأقل أربع تكرارات وكرر التجربة بأكملها ثلاث مرات على الأقل.

5. التعبير عن rAbs ضد APN

1. استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من خلايا الورم الهجين المذكورة أعلاه وطحال الفئران المحصنة ب APN (على سبيل المثال ، TRIzol). قم بتصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة توليف (كدنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. تضخيم المناطق المتغيرة من mAbs باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (PCR) وتحديد تسلسل السلسلة الثقيلة (VH) والسلسلة الخفيفة (VL) باستخدام التسلسل. قم بتحليل الجينات التي تشفر VH و VL باستخدام أداة تحليل جينوم الفأر IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. اجمع بين جينات VH و VL مع التسلسلات الرائدة واستنساخها بالتتابع في ناقلات pET28a (+) و pIRES2-ZsGreen1 ، على التوالي ، باستخدام تقنية الاستنساخ السلس للسماح بإدخال جزء الحمض النووي بدون ندوب. يتم سرد البادئات المحددة في الجدول 1.
4. قم بزراعة البكتيريا المحولة pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 في وجود 0.4 ملي مولار IPTG في الهزازات المدارية عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات. ثم قم بتحفيز وتنقية وتقييم التعبير عن بروتين rAbs باستخدام تنقية البروتين الروتينية.
5. قم ببذور 100 ميكرولتر 0.5 × 10⁵ خلايا CHO لكل بئر في صفيحة مكونة من 96 بئرا وتحتضن عند 37 درجة مئوية في جو 6٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 18-24 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪ ، قم بتخفيف البلازميد pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN باستخدام Opti-MEM إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه للتعداد.
6. امزج برفق 50 ميكرولتر من بلازميد pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN المخفف مع 1 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 و 49 ميكرولتر من Opti-MEM واحتضان الخليط لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على خلايا CHO واحتضانها عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي 6٪ CO₂ لمدة 4-6 ساعات.
7. في 4-6 ساعات بعد التعدي ، استبدل الوسط بوسط DMEM-F12 مكمل بنسبة 10٪ FBS ، واحتضن اللوحة لمدة 48 ساعة أخرى. ثم أضف 400 ميكروغرام / مل G418 إلى كل بئر لتحديد الخلايا التي تم نقلها بثبات.
8. بعد 10 أيام من الانتقاء باستخدام وسيط DMEM-F12 المكمل بنسبة 10٪ FBS و 400 ميكروغرام / مل G418 ، قم بفرز الخلايا (3.0 × 10⁷ خلايا / مل) عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. ما يقرب من 10-15٪ من سكان الخلايا كانوا إيجابيين.
9. الخلايا الموجبة المخففة بشكل متسلسل ، والبذور بمعدل 0.5-2 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا ، وزراعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂. حافظ على خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO المنقولة بثبات باستخدام التحديد باستخدام G418 (200 ميكروغرام / مل).
10. ينخفض تركيز FBS في وسط زراعة الخلايا الموصوف أعلاه تدريجيا من 10٪ إلى 0٪ خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي خلال فترة زمنية مدتها 3 أسابيع. بعد ذلك ، قم بتكييف خلايا CHO الملتصقة مع نمو التعليق في وسط خال من المصل.
11. استزراع خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO المصنفة في مرحلة النمو اللوغاريتمي في وسط خال من المصل بكثافة 0.8-1.0 × 10⁵ خلايا / مل في قوارير اهتزاز بسرعة اهتزاز 80-110 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
12. اجمع معلق الخلية كل 12 ساعة لتحديد التغيرات في صلاحية الخلية وحيويتها باستخدام مجموعة عد الخلايا (على سبيل المثال ، CCK-8) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
13. يصل تعبير الأجسام المضادة إلى مستويات الذروة عندما تنخفض صلاحية الخلية إلى 80٪ وتصل كثافة الخلايا إلى 1.0-2.0 × 10⁶ خلايا / مل. حصاد المواد الطافية للخلايا باستخدام الطرد المركزي ، والتصفية باستخدام مرشح غشاء بولي تترافلورو إيثيلين 0.22 ميكرومتر ، وتنقيتها باستخدام بروتين أ الاغاروز.
14. تأكيد إنتاج الأجسام المضادة الخاصة ب APN باستخدام فحوصات التألق المناعي غير المباشر (IFA).
15. تحديد عيار الأجسام المضادة وصلات الارتباط باستخدام مقايسة ELISA كما هو موضح سابقا. احسب ثابت تفكك التوازن (قيمة_KD) للأجسام المضادة بمعادلة لوجستية من أربع معلمات باستخدام البرنامج.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. البادئات المحددة المستخدمة في هذه الدراسة.

التمهيدي التسلسل (5'-3') VH-VL-F CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG VH-VL-R CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT pET28a (+)-F TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACGGTCGTGATTCGA pET28a (+)-R CTGGTGCCGCGCGGCAGCCCAGCAGTGGGATACCCGTATTACCC pIRES2-ZsGreen1-F CGACGGTACCGCGGGCCCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA [ب] 2-ZsGreen1-R GGGGGGGAGGGGGGGGGGGGGacccgtattaccc

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أكمل مساعد فرويند سيجما ألدريتش F5881 تحصين دابي بيوتيم بيوتكنولوجي سي 1002 صبغة نواوية DMEM جيبكو 11965092 زراعة الخلايا DMEM-F12 جيبكو 12634010 زراعة الخلايا Dylight 549 الماعز المترافق المضاد للجسم المضاد IgG الثانوي أبكين أ 23310 تحليل التألق المناعي غير المباشر مجموعة عد الخلايا المحسنة -8 بيوتيم بيوتكنولوجي سي 0042 قياس صلاحية الخلية وحيويتها مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10091 زراعة الخلايا المضادات الحيوية الانتقائية Geneticin™ جيبكو 11811098 مضاد حيوي انتقائي مكمل HAT (50X) جيبكو 21060017 اختيار الخلية مكمل HT (100X) جيبكو 11067030 اختيار الخلية مساعد فرويند غير مكتمل سيجما ألدريتش F5506 تحصين الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside سيجما ألدريتش أولا 5502 تعبير البروتين كاناميسين بيوتيم بيوتكنولوجي ST102 مضاد حيوي مبيد للجراثيم مجهر متحد البؤر Leica TCS SP8 STED لايكا مايكروسيستمز SP8 ستيد التصوير الفلوري كاشف ليبوفيكتامين® 2000 ثيرموفيشر 11668019 تعداء LSRفرز™ الخلايا المنشطة بالفلورة دينار بحريني FACS LSRفورتيسا قياس التدفق الخلوي قارئ اللوحة الدقيقة بيوتك صندوق 998 تحليل ELISA مقياس الطيف الضوئي الصغير ثيرمو فيشر نانو قطرة واحدة الكشف عن تركيز الحمض النووي كلوريد الصوديوم كاشف سينوفارم الكيميائي 10019308 مرق الثقافة (NH4) 2SO4 كاشف سينوفارم الكيميائي 10002917 مرق الثقافة أوبتي-ميم جيبكو 31985088 زراعة الخلايا بولي إيثيلين جلايكول 1500 تشخيص روش 10783641001 اندماج الخلية PrimeScript™ 1st حبلا (كدنا) التوليف كيت تاكارا بيو RR047 qPCR بروتين أ الاغاروز بيوتيم بيوتكنولوجي ب2006 تنقية بروتين الأجسام المضادة أعمدة معبأة من Protino® Ni + -TED 2000 ماشيري ناجل 745120.5 تنقية البروتين نظام استنساخ SBA-HRP التكنولوجيا الحيوية الجنوبية مايو 00 النمط المتماثل للأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر طقم استنساخ سلس بيوتيم بيوتكنولوجي D7010S بناء البلازميدات قوارير رج بيوتيم بيوتكنولوجي E3285 زراعة الخلايا كربونات الصوديوم بيكربونات الصوديوم عازلة بيوتيم بيوتكنولوجي C0221A زراعة الخلايا خلية نقل شبه جافة عبر لطخة SD بيو راد 170-3940 لطخة غربية التربتون أوكسويد لب0042 مرق الثقافة الخالط بالموجات فوق الصوتية نينغبو Xinzhi التكنولوجيا الحيوية JY92-IIN تجانس العينة مستخلص الخميرة أوكسويد لب0021 مرق الثقافة 96 بئر صفيحة كورنينج 3599 [إ] زراعة الخلايا