مقايسة التنشيط الاصطناعي في المختبر لدراسة تنشيط مستقبلات Fc بواسطة الأجسام المضادة

الملخص

المصدر: Petriello، A. et al. تقييم أحداث الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية مدفوعة بمشاركة FcγRIIIa في وجود الأجسام المضادة العلاجية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو الأحداث التي تحركها FcγRIIIa التي بدأتها الأجسام المضادة العلاجية في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. تسهل منصة التحفيز الاصطناعي استكشاف وظائف المستجيب النهائي ، بما في ذلك إعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، والتحلل ، وإنتاج الكيموكين / السيتوكين ، ومسارات الإشارات بوساطة أجزاء FcγRIIIa و Fc من الأجسام المضادة المشاركة في الربط.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. عزل PBMCs وإثراء / تنقية الخلايا القاتلة

الطبيعية < p class = "jove_content" >ملاحظة: يمكن أيضا إجراء طرق أخرى لعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) والتخصيب / التنقية.

1. اسحب 200 مل من الدم في ظل ظروف منظمة في أنبوب يحتوي على الهيبارين.
2. أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة في أنبوب سعة 50 مل مع حاجز مسامي مدمج. قم بتدوير الأنبوب عند 1000 × جم لمدة 30 ثانية.
3. أضف 12.5 مل من الدم إلى الأنبوب ، متبوعا ب 12.5 مل أخرى من PBS ، واقلب 3x برفق. قم بتدوير الأنبوب عند 800 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون انقطاع.
4. قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 40 مل من PBS لكل أنبوب بحاجز مسامي أثناء دوران الخلايا.
5. قم بإزالة الأنابيب بعناية وافحصها بعد الطرد المركزي. تحقق من وجود طبقة رقيقة بيضاء بشكل واضح من PBMCs فوق الحاجز المسامي ، بين ترسيم 20 مل و 25 مل على أنبوب 50 مل.
6. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل بعناية من الأعلى باستخدام ماصة دون إزعاج طبقة PBMC البيضاء الرقيقة.
7. باستخدام ماصة مصلية نظيفة سعة 10 مل، قم بإزالة طبقة PBMC برفق بالإضافة إلى الطبقة السائلة الصافية المصفرة وصولا إلى مرشح الأنبوب.
8. طرد PBMCs والسائل في 50 مل مخروطي الشكل يحتوي على PBS المحضر في الخطوة 1.4. أنابيب الدوران عند RT و 300 × جم لمدة 5 دقائق.
9. قم بشفط غسل PBS وأضف 40 مل إضافيا من PBS. أنابيب الدوران عند RT و 300 × جم لمدة 5 دقائق.
10. بعد الغسيل ، عد الخلايا وأعد تعليقها في 40 ميكرولتر من 2٪ BSA / PBS لكل 1 × 10⁷ خلايا.
11. انتقل إلى عزل الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام الطريقة المختارة. تشمل الخيارات الفرز اليدوي أو الآلي القائم على الخرزة المغناطيسية. يمكن أيضا إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.
12. قم بإزالة كمية صغيرة من الخلايا لتحديد نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتضمن استراتيجية البوابات ما يلي: بوابة على الخلايا الحية بناء على ملف تعريف التشتت الأمامي مقابل الجانب ، ثم تقييم النقاء بناء على علامات NK (على سبيل المثال ، CD3 ، CD56) في السكان الأحياء المحددين. النقاء النموذجي هو >95٪.
13. بعد اكتمال العزل ، قم بتدوير الخلايا عند RT و 300 × جم لمدة 5 دقائق للحبيبات والشفاط.
14. أعد تعليق حبيبات الخلية إلى 1 × 10⁷ خلايا / مل في RPMI 1640 مع العناصر الغذائية ، و 10٪ FBS معطل بالحرارة ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 55 ملي مولار 2-ME ، و 10 ملي مولار HEPES (الرقم الهيدروجيني = 7.2).

< p class = "jove_title" >2. التنشيط بوساطة الأجسام المضادة للخلايا القاتلة الطبيعية عبر FcγRIIIa

1. اضبط جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على 4 درجات مئوية.
2. قم بتوزيع 1 × 10⁶ (100 ميكرولتر من) الخلايا القاتلة الطبيعية المعلقة في أنبوب (أنبوب) سعة 1.5 مل وضعها على الثلج.
   ملاحظه: يمكن توزيع الخلايا في صفيحة قاع 96 بئر إذا كان هناك العديد من العينات.
3. قم بإعداد 1 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل ريتوكسيماب (أو الجسم المضاد المهم) لكل عينة وأضف 1 ميكرولتر إلى الخلايا للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد.
   ملاحظه: يمكن إضافة جزيئات أخرى إلى الخلايا في هذه المرحلة أو قبل ذلك لتقييم التأثيرات المركبة. هنا ، تم استخدام ريتيكسوماب للتحفيز. في الدراسات السابقة ، تمت إضافة مثبطات الجزيئات الصغيرة إلى التحفيزات.
4. احتضان العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد للسلسلة الخفيفة المضاد للإنسان لكل عينة في الوسائط وتسخينه إلى 37 درجة مئوية على كتلة حرارية أو في حمام مائي.
5. بعد حضانة الخلايا على الجليد ، أضف 1 مل من الوسائط الباردة المثلجة وقم بالدوران عند 135 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. قم بشفط المادة الطافية بعد الغسيل الأخير وأضف 50 ميكرولتر من خليط السلسلة الخفيفة المضاد للإنسان المحضر في الخطوة 2.4.
7. احتضان العينات على الفور للنقاط الزمنية التي يحددها المستخدم النهائي عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية أو في حمام مائي.
8. أوقف التحفيز بإضافة 1 مل من الوسائط الباردة المثلجة وقم بتدوير العينات على الفور في جهاز طرد مركزي مبرد بوزن 135 × جم لمدة 5 دقائق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 16٪ بارافورمالدهيد ثيرمو فيشر العلمي 50-980-487 أليكسا فلور 488 فالويد ثيرمو فيشر العلمي أ 12379 الجسم المضاد HRP المضاد للفأر تقنيات إشارات الخلية 7076 [م] أداة AutoMACS ميلتيني طريقة عزل الخلايا القاتلة الطبيعية ؛ يمكن استخدام أداة عزل أخرى CD107a APC الأجسام المضادة بيوليجند هاتف: 328620 مصل الألبومين البقري Fraction V ، خالي من الأحماض الدهنية ميليبور سيجما 10775835001 لوحة الإنسان Cytokine 30-Plex ثيرمو فيشر العلمي LHC6003M طريقة الكيموكين / السيتوكين ؛ يمكن استخدام طريقة أخرى لتحليل الكيموكين / السيتوكين FBS (مصل الأبقار الجنينية) هيكلون SH30071.01 الماعز المضادة للإنسان κ سلسلة خفيفة
جسم ميليبور سيجما AP502 أوقف البروتياز وكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز ثيرمو فيشر العلمي 78440 الجسم المضاد pAKT (S473) تقنيات إشارات الخلية الجسم المضاد pERK1 / 2 تقنيات إشارات الخلية الجسم المضاد pPRAS40 تقنيات إشارات الخلية 13175 [إ] β-أكتين الأجسام المضادة HRP أبكام أب6721 طقم عزل الخلايا NK ميلتيني 130-092-657 طقم عزل الخلايا القاتلة الطبيعية ؛ يمكن استخدام مجموعة عزل أخرى