تقنية لتوليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من الخلايا البائية الخاصة بالمستضد

الملخص

المصدر: Devilder، M.، et al. توليد الأجسام المضادة البشرية أحادية النسيلة التمييزية من الخلايا البائية النادرة الخاصة بالمستضد المنتشرة في الدم. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح الفيديو تقنية لتوليد أجسام مضادة وحيدة النسيلة من الخلايا البائية الخاصة بالمستضد. يتم إدخال نواقل التعبير حقيقية النواة التي تشفر السلاسل الثقيلة والخفيفة من الأجسام المضادة ، المستنسخة من الخلايا البائية المعزولة الخاصة بالمستضد ، في خلايا الثدييات باستخدام polyplexes. بمجرد دخولها إلى الخلايا ، تخضع هذه النواقل للترجمة ، وتتجمع الببتيدات الثقيلة والخفيفة الناتجة في أجسام مضادة ، والتي تفرزها الخلايا لاحقا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إنتاج mAbs

1. في اليوم السابق للتعدي ، بذرة 15,000 خلية من خلايا الكلى الجنينية البشرية 293A (HEK 293A) في 200 ميكرولتر من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ FBS لكل بئر في 96 لوحة بئر. احتضن طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) عند 37 درجة مئوية.
2. خلايا Cotransfect 293A في وسط DMEM يحتوي على 10٪ FBS باستخدام مشتق خطي من البولي إيثيلينيمين ككاشف تعداد.
   ملاحظه: قم بإجراء التعدي في ثلاث نسخ. البروتوكول التالي مخصص لبئر واحد من صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا.
   1. خفف 0.5 ميكرولتر من كاشف تعداء الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر من 150 ملي كلوريد الصوديوم. خفف 0.125 ميكروغرام من السلسلة الثقيلة المتغيرة (vH) و 0.125 ميكروغرام من المتجهات المتغيرة للسلسلة الخفيفة (vL) التي تعبر عن المتجهات إلى 10 ميكرولتر من 150 ملي كلوريد الصوديوم. دوامة كل تخفيف لمدة 10 ثوان.
   2. أضف 10 ميكرولتر كاشف تعداء الحمض النووي المخفف إلى محلول الحمض النووي سعة 10 ميكرولتر. دوامة 15 ثانية واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف المزيج سعة 20 ميكرولتر على خلايا 293 أمبير ، واخلطه عن طريق تحريك الطبق برفق.
3. استبدل الوسط بعد 16 ساعة من التعداء والخلايا المزروعة لمدة 5 أيام في وسط خال من المصل.
   ملاحظه: استخدم وسيطا خاليا من المصل لتجنب تلويث الغلوبولين المناعي في الدم (Igs) الأجسام المضادة المنتجة.
4. تخلص من الخلايا والحطام عن طريق الطرد المركزي عند 460 × جم لمدة 5 دقائق.
5. احصد المواد الطافية عن طريق الشفط باستخدام ماصة متعددة القنوات وانقلها إلى صفيحة 96 بئرا ذات قاع V.
6. قم بتغطية Ag ذات الصلة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في 100 ميكرولتر لكل بئر من مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المعاد تكوينها (ELISA) / بقعة الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم (ELISPOT) 1x بتركيز نهائي قدره 2 ميكروغرام / مل في ألواح ELISA ذات 96 بئر.
7. سد الآبار مع 10٪ FBS DMEM متوسط لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
8. أضف 50 ميكرولتر من المواد الطافية لخلايا 293A المنقولة من الخطوة 1.5 ، واحتضن لمدة ساعتين في RT.
9. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للجلوبولين المناعي G المضاد للإنسان (IgG Ab) المقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) عند 1 ميكروغرام / مل واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف 50 ميكرولتر من الركيزة الملونة (3،3 '، 5،5' رباعي ميثيل بنزيدين ، TMB) ، واحتضنها لمدة 20 دقيقة.
10. اقرأ الكثافة البصرية عند 450 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظه: يمكن إنتاج mAbs المحددة التي كشفت عنها مقايسة ELISA على نطاق واسع وتنقيتها على عمود البروتين A الذي يقدم تقاربا مع IgG البشري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط خلية HEK 293A ثيرمو فيشر العلمية R70507 DMEM (1X) وسط النسر المعدل من Dulbecco جيبكو من لايف تكنولوجيز 21969-035 (+) 4,5 جم / لتر D-Glucose
0،11 جم / لتر بيروفات الصوديوم
(-) ل-جلوتمين نوتريدوما-SP روش 11011375001 100X Conc مصل الأبقار الجنينية (FBS) دومينيك دوتشر S1810-500 كاشف تعداء الحمض النووي Jet PEI بولي بلس 101-40 قاع مسطح96 لوحة بئر صقر 353072 صفيحة 96 بئر على شكل حرف V Nunc / Thermofisher 55142 م