توصيل الأجسام المضادة المعززة بالحمل الحراري إلى دماغ الفأر

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير أنبوب السيليكا المنصهر لخطوة القسطرة
   1. قطع الشعيرات الدموية المدمجة من السيليكا بقطر داخلي يبلغ 0.1 مم وسمك الجدار 0.0325 مم بطول 30 مم.
   2. افحص الأنبوب بحثا عن الشقوق وتلميع الأطراف بالحرارة باستخدام microforge للتأكد من أن فتحات الأنابيب لها سطح أملس.
2. تثبيت الأنبوب الداخلي في إبرة معدنية
   1. قم بتركيب إبرة 27 جم على حقنة سعة 10 ميكرولتر وضع المحقنة في روبوت تجسيمي.
   2. باستخدام الروبوت ، حرك المحقنة على سطح صلب ولمسها بطرف الإبرة. يجب ملاحظة هذا الموضع أو حفظه في البرنامج لأنه سيكون بمثابة سطح مرجعي لضبط طول خطوة القسطرة.
   3. ارفع الإبرة لتمكين وضع الشعيرات الدموية المدمجة للسيليكا داخل الإبرة.
   4. ضع الشعيرات الدموية المدمجة من السيليكا في الإبرة بحيث يبرز 20 مم من الشعيرات الدموية من الإبرة.
   5. باستخدام ماصة ، وزعي بالتساوي 2 ميكرولتر من مادة لاصقة سيانواكريليت عالية اللزوجة فوق الشعيرات الدموية ، بدءا من الإبرة المعدنية وتنتهي بمقدار 10 مم فوق الطرف السفلي للشعيرات الدموية ، كما هو موضح في الشكل 1.
   6. باستخدام الروبوت التجسيمي ، اخفض الإبرة حتى يصبح طرف الإبرة المعدنية 1 مم فوق السطح المرجعي. بهذه الطريقة ، سيتم تثبيت الشعيرات الدموية المصنوعة من السيليكا المنصهرة في الإبرة المعدنية ، لتشكيل خطوة 1 مم من الحافة. قم بإزالة أي غراء زائد يتشكل في نهاية الإبرة المعدنية لتجنب إضعاف الخطوة.
   7. انتظر 15 دقيقة حتى يتصلب الغراء ، وقم بإزالة المحقنة بالقسطرة من الروبوت التجسيمي. تأكد من إزالة كل الغراء الزائد في الخطوة عن طريق فحص طرف القسطرة تحت المجهر.
3. اختبار القسطرة المتدرجة باستخدام كتلة من الاغاروز
   1. قم بإعداد محلول الاغاروز بنسبة 0.6٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في صينية هلامية تقليدية وانتظر حتى يتبلمر. قطع الاغاروز إلى كتل 20 مم × 20 مم تقريبا. حتى الاستخدام ، احتفظ بالكتل مغمورة في PBS.
   2. املأ حقنة القسطرة المتدرجة يدويا بمحلول 10 ميكرولتر من محلول 0.4٪ من التريبان الأزرق المصفى.
   3. باستخدام الروبوت التجسيمي ، قم بتوزيع 1 ميكرولتر عند 0.2 ميكرولتر / دقيقة لتقييم إحكام غلق خطوة القسطرة أثناء إجراء التثبيت. يجب أن يكون محلول التريبان الأزرق مرئيا فقط على طرف القسطرة. امسحها بمنديل ورقي.
   4. ضع كتلة الاغاروز في الروبوت التجسيمي وقم بمعايرة الروبوت بحيث يتم الإشارة إلى طرف القسطرة على سطح كتلة الاغاروز.
   5. برمجة معلمات الحقن ل CED.
      1. بالنسبة لحجم الحقن البالغ 5 ميكرولتر ، استخدم الخطوات التالية: 1 ميكرولتر عند 0.2 ميكرولتر / دقيقة ، ثم 2 ميكرولتر عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة و 2 ميكرولتر عند 0.8 ميكرولتر / دقيقة. اضبط حجم الحقن النهائي وفقا للخطة التجريبية المحددة عن طريق تغيير مدة كل خطوة بشكل متناسب.
      2. لحقن المحلول في الفئران المذيبة بوتامين (المخطط) ، قم بإجراء هذا الحقن في وضع 1 مم أمامي و 1.5-2 مم جانبي من بريجما على عمق 3.5 مم.
      3. بعد الحقن ، اترك القسطرة في مكانها لمدة دقيقتين ثم تراجع بسرعة 1 مم / دقيقة لضمان تشتت السوائل بشكل صحيح في الدماغ وإغلاق قناة الحقن أثناء إزالة القسطرة.
         ملاحظه: يمكن برمجة جميع المعلمات في برنامج نصي واحد اعتمادا على الروبوت التجسيمي المحدد.
   6. ابدأ إجراء CED وحقن 5 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق في كتلة الاغاروز.
   7. قم بتقييم شكل سحابة من التريبان الأزرق في الاغاروز والتسرب المحتمل على طول قناة القسطرة. يجب أن يشكل اللون الأزرق المجربية سحابة بيضاوية الشكل أو سحابة مستديرة مع مركز حول طرف القسطرة وقطرها لا يقل عن 1 مم. يجب ألا يكون هناك تدفق عكسي كبير على طرف الإبرة المعدنية مرئيا.
   8. ضع كتلة agarose جديدة وابدأ حقنة ثانية من 1 ميكرولتر عند 0.2 ميكرولتر / دقيقة لتقييم انسداد القسطرة مع الاغاروز. يجب أن يبدأ التريبان الأزرق مرة أخرى في تكوين سحابة من طرف القسطرة مباشرة بعد بدء الحقن.
   9. قم بتقييم ما إذا كان الحجم المتبقي في المحقنة يتوافق مع 3 ميكرولتر. قد تشير أي اختلافات إلى تسرب السوائل من خلال تركيب القسطرة أو مكبس المحقنة.
   10. إذا نجحت جميع حقن الاختبار ، فإن القسطرة محكمة الغلق ومستقيمة ، ولم يلاحظ أي محلول أزرق من أماكن أخرى غير طرف القسطرة ، اغسل القسطرة ب H₂O منزوع الأيونات (dH₂O) حتى لا تظهر أي آثار من التريبان الأزرق ثم اغسل عشر مرات على النحو التالي: 70٪ إيثانول و 100٪ إيثانول متبوعا بالشطف مرة أخرى بنسبة 70٪ إيثانول وماء نظيف منزوع الأيونات.
   11. قم بتخزين القسطرة في ظروف جافة.

2. توصيل محلول الأجسام المضادة المعزز بالحمل الحراري إلى دماغ الفئران

ملاحظة: اعتمادا على لوائح رعاية المحلية ، يمكن تنفيذ أنواع مختلفة من التخدير والمسكنات والمضادات الحيوية لهذا الإجراء. يصف هذا البروتوكول استخدام التخدير بالحقن. يمكن أيضا استخدام التخدير الاستنشاقي مثل الأيزوفلوران عن طريق تركيب قناع الأنف على الإطار التجسيمي. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي بإضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب للوقاية من العدوى.

1. الإعداد الجراحي
   1. تحضير التخدير ومحاليل الترياق. يمكن تخدير الفئران بأمان باستخدام تخدير مكون من ثلاثة مكونات يحتوي على الفنتانيل (0.05 مجم / كجم) ، وميدازولام (5 مجم / كجم) ، وميديتوميدين (0.5 مجم / كجم) مخفف في ماء مقطر معقم (dH₂O). نقوم بإجراء إيقاظ من خطوتين باستخدام محلولي ترياق ، أحدهما يحتوي على فلومازنيل (0.5 مجم / كجم) وبوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) في dH₂O المعقم (محلول الترياق الأول). والثاني يحتوي على أتيباميزول (2.5 مجم / كجم) في dH₂O المعقم (محلول الترياق الثاني).
   2. تحضير محلول تسكين يحتوي على كاربروفين (5.667 مجم / كغ) مخفف بدرجة حرارة₂درجة حرارة معقمة.
   3. قم بتنظيف الإطار التجسيمي ووسادة التدفئة وعناصر الروبوت التجسيمي. ضع في اعتبارك أنه لا يمكن تنظيف جميع أجزاء الروبوت دون التعرض لخطر التلف. راجع دليل الروبوت للحصول على تفاصيل حول التنظيف والتحضير للاستخدام.
   4. قم بتجميع المحقنة باستخدام القسطرة المتدرجة واغسلها عدة مرات باستخدام dH₂O و 70٪ إيثانول و 100٪ إيثانول ، متبوعا بالتنظيف مرة أخرى باستخدام 70٪ إيثانول و dH₂O. أخيرا ، اغسل المحقنة ب PBS أو مخازن مؤقتة أخرى لتحضير المحلول للحقن داخل الجمجمة ، على سبيل المثال ، السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي. يجب أن يتحرك مكبس المحقنة بسلاسة وحرية أثناء العملية.
   قم
   5. بمعايرة برنامج الروبوت التجسيمي باستخدام الإطار التجسيمي.
   6. اختبر برنامج الروبوت التجسيمي من خلال التأكد من أن أذرع الروبوت تتحرك بحرية ، وأن مضخة الحقن متصلة بشكل مناسب ، وأنه يمكنها تنفيذ إجراء CED دون أي اضطرابات. يتضمن ذلك اختبار حركة الروبوت ، وحقن التكثيف ، والتحقق من خطوة الانتظار لمدة دقيقتين ، والتحقق من سرعة تراجع القسطرة. وينبغي أن تتناسب جميع المعلمات مع إجراء CED المبرمج مسبقا الموصوف في النقطة 1-3-5.
   7. أدخل لقمة الحفر في المثقاب. يوصى بتعقيم لقم الثقب قبل الاستخدام.
   8. تحضير محلول الأجسام المضادة باستخدام PBS أو المحاليل العازلة الأخرى مثل السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF). يمكن حقن 1 إلى 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة في 5 ميكرولتر في إجراء واحد من CED. يجب اختبار الأحجام الأخرى وكميات البروتين قبل إجراء التجربة. اعلم أن استخدام المحاليل عالية اللزوجة قد يؤدي إلى انسداد القسطرة.
   9. قم بتحميل المحقنة يدويا بالجسم المضاد المخفف.
2. حقن الأجسام المضادة عن طريق CED في المخطط
   1. قم بوزن الفأر وحقن محلول التخدير المكون من ثلاثة مكونات في الصفاق وفقا لوزن الجسم. لاحظ وقت الحقن. انقل الماوس إلى قفص منفصل ساخن باستخدام وسادة تدفئة.
   2. راقب الماوس لتحديد وقت بدء التخدير. عندما يتوقف الفأر عن الحركة ، ضع مرهم العين على العينين لحماية القرنية من الجفاف أثناء الجراحة. يبدأ التخدير الكامل عادة بعد 10-15 دقيقة من حقن محلول التخدير المكون من ثلاثة مكونات.
   3. تحقق من تفاعلات الألم باستخدام اختبار الانعكاس لضمان التخدير الكامل للحيوان.
   4. احلق الرأس باستخدام أداة تشذيب الشعر.
   5. تطهير الجلد بمسحات قطنية مبللة بمحلول اليود. افرك الجلد ثلاث مرات بحركة دائرية.
   6. قم بعمل شق جلدي بطول 10 مم على طول خط الوسط الجمجمي ، مع الانتهاء من مستوى العين باستخدام مشرط.
   7. قم بتثبيت الماوس في الإطار التجسيمي باستخدام مشبك الأنف وقضبان الأذن. تأكد من أن سطح الجمجمة أفقي ومؤمن بإحكام. إلى جانب الملاحة التشريحية الصحيحة ، من الضروري أيضا تجنب إمالة الجمجمة أثناء الحفر وإجراء CED.
   8. ضع المحقنة في الروبوت التجسيمي.
   9. قم بمزامنة لقمة الحفر مع طرف القسطرة على نقطة مرجعية. يجب تحديد العلاقة بين موضع المثقاب والحقنة بدقة في البرنامج بحيث يمكن إجراء الحقن في المنطقة التشريحية المرغوبة من الدماغ.
   10. اسحب الجلد باستخدام الملقط وقم بتوطين البريجما على سطح الجمجمة.
   11. المرجع Bregma في البرنامج باستخدام طرف مثقاب الحفر.
   12. انقل المثقاب إلى وضع 1 مم أمامي و 2 مم جانبي من بريجما وحفر حفرة لدغ. احرص على عدم إتلاف الأم الجافية.
   13. حرك المحقنة فوق فتحة الأزيز.
   14. قم بتوزيع 0.5-1 ميكرولتر من المحقنة لضمان عدم ترك فقاعات هواء في القسطرة.
   15. ابدأ برنامج CED الموضح في النقطة 1.3.5. راقب سطح الجمجمة بحثا عن أي آثار لتدفق السوائل من بقعة الحقن. مراقبة معدل تنفس.
   16. بمجرد انتهاء برنامج CED وسحب القسطرة من الدماغ ، ابدأ مضخة الحقن عند 0.2 ميكرولتر / دقيقة للتحقق من انسداد القسطرة أثناء CED. إذا لم يحدث انسداد ، يجب أن ترى على الفور قطرة من مزيج الحقن من طرف القسطرة.
   17. قبل إعادة استخدام القسطرة أو تخزينها ، افحص خطوة القسطرة بصريا تحت المجهر بحثا عن أي علامات تلف أو تآكل ونظفها كما في الخطوة 1.3.10.

الشكل 1: رسم تخطيطي يصور منطقة تطبيق المادة اللاصقة. يتم إدخال الجزء العلوي من 10 مم من أنابيب السيليكا المنصهرة في الإبرة المعدنية. ضع الغراء على الأنبوب مقاس 10 مم بدءا من طرف الإبرة المعدنية.