اختبار قائم على الخلايا لتقييم امتصاص بروتين تاو بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة

الملخص

المصدر: De Marco، D. et al. ، الفحص القائم على الخلايا لدراسة إزالة تاو بوساطة الأجسام المضادة بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة.J. Vis. Exp. (2018)

يعرض هذا الفيديو فحصا قائما على الخلايا يحدد امتصاص تاو بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة الفئران باستخدام مجاميع تاو المسماة بالفلورسنت الحساسة للأس الهيدروجيني ، والتي تم تحليلها عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لإجراء تقييم كمي.

البروتوكول

فئة

1. BV-2 ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: تعامل مع خلايا BV-2 تحت احتواء السلامة البيولوجية من المستوى 2. ينتج خط خلايا BV-2 فيروسا قهقريا صديقا للبيئة المؤتلف مغلفا (قادر على إصابة خلايا الفئران فقط) ؛ تشتهر هذه الفيروسات بقدرتها على التحويل في المختبر وإمكانات الأورام في الجسم الحي.

1. زراعة خلايا BV-2 في وسط النسر المعدل (DMEM) من الغلوكوز العالي (DMEM) المكملة بمصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين و 2 ملي مولار L-Glutamine (يشار إليه باسم وسط الاستزراع من الآن فصاعدا) عن طريق بذر الخلايا عند 4 × 10⁴ خلايا / مل.
2. الحفاظ على المزارع في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية
   ملاحظة: تنمو الخلايا بشكل فضفاض وفي حالة تعليق.

فئة

2. تسمية مجاميع تاو المؤتلفة بصبغة فلورية حساسة للأس الهيدروجيني

ملاحظة: تم إعداد مجاميع تاو كما هو موضح في Apetri et al.مع اختلاف أنه لم تتم إضافة Thioflavin T (ThT) إلى المخزن المؤقت للتفاعل. تم جمع العينات المجمعة في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل. تم فحص إشارة التألق النهائية عن طريق خلط 118 ميكرولتر من عينة البركة مع 12 ميكرولتر من محلول ThT 50 ميكرومتر. تم فصل الركام عن طريق الطرد المركزي لخليط تفاعل التجميع عند 20,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. تم تحليل المادة الطافية بواسطة SEC-MALS للتأكد من أن كل التاو الأحادي قد تم تحويله إلى مجاميع. تم تجميد الكريات (مجاميع تاو) وتخزينها في الفريزر عند -80 درجة مئوية.

1. أعد تعليق مجاميع تاو في محلول بيكربونات الصوديوم 0.1 M (NaHCO₃) عند درجة الحموضة 8.5 إلى تركيز 1 مجم / مل (~ 20 ميكرومتر).
   ملاحظه: يعتمد تركيز مجاميع تاو على تركيز المونومرات الأولي كما تم تقييمه من خلال امتصاص مونومرات تاو عند 280 نانومتر باستخدام معامل انقراض 0.31 مل ^ملغ-1سم ^-1.
2. قم بتقطيع الركام المعلق باستخدام مكبر صوتي مسبار مع إبقائها على الجليد لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
   1. استخدم سعة 65٪ (مع مكبر صوتي بقوة 250 واط).
   2. قم بإجراء 8 نبضات من 3 ثوان مع توقف مؤقت لمدة 15 ثانية بين النبضات لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
3. قم بإعداد محلول مخزون 8.9 ملي مولار من الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم صبغة الأس الهيدروجيني) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظه: قم دائما بإعداد محلول جديد واستخدمه فقط في يوم تحضيره.
4. أضف 10 مولات من الصبغة لكل مول من البروتين إلى تركيز الصبغة النهائي البالغ 0.2 ملليمتر.
5. امزج عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل.
6. احتضان خليط التفاعل لمدة 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.
7. في غضون ذلك ، قم بتجميع عمود تحلية هلام ديكستران متقاطع باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
8. قم بموازنة العمود ب 25 مل من 0.1 M NaHCO₃ المخزن الهيدروجيني 8.5 الذي يحتوي على 3٪ DMSO. تجاهل التدفق من خلال.
9. أضف حاصل ضرب تفاعل وضع العلامات الركامية تاو إلى العمود بحجم إجمالي قدره 2.5 مل. إذا كانت العينة أقل من 2.5 مل ، فأضف المخزن المؤقت حتى يتم تحقيق حجم إجمالي قدره 2.5 مل.
10. دع العينة تدخل الجل المعبأ تماما ، وتخلص من التدفق.
11. قم بإزالة 3.5 مل من 0.1 M NaHCO₃ المخزن الهيدروجيني 8.5 الذي يحتوي على 3٪ DMSO وجمع الشطف في 4 كسور مكافئة في أنابيب 2 مل.
12. تحديد تركيزات البروتين للكسور الأربعة عن طريق فحص حمض البيسينجونينيك (BCA).
13. قم بتخزين البروتين الملصق في فريزر -20 درجة مئوية.

3. فحص الامتصاص مع قراءة فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)

1. يوم 1 - بذر الخلايا
   1. اغسل خلايا BV-2 في القارورة عن طريق إزالة وسط الاستزراع وإضافة 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). < / > ملاحظه: سيختلف حجم الغسيل بناء على حجم قارورة الخلية المستخدمة. على سبيل المثال ، بالنسبة لقارورة T175 ، اغسل ب 10 مل من 1x PBS.
   2. قم بإزالة PBS من القارورة وفصل الخلايا عن طريق احتضانها بحمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) 0.05٪ عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تنفصل الخلايا عن القارورة (حوالي 5 دقائق).
      ملاحظه: يعتمد حجم التربسين EDTA بنسبة 0.05٪ على حجم قارورة الخلية المستخدمة. على سبيل المثال ، بالنسبة لقارورة T175 ، استخدم 2 مل من التربسين-EDTA 0.05٪.
   3. أعد تعليق الخلايا في وسط الاستزراع عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات.
      ملاحظة: يختلف حجم وسط الاستزراع بناء على حجم قارورة الخلية المستخدمة وبالتالي العدد الإجمالي للخلايا في القارورة. على سبيل المثال ، بالنسبة لقارورة T175 ، استخدم 8 مل من وسط الاستزراع.
   4. عد الخلايا وإنشاء معلق خلوي بتركيز نهائي 1 × 10⁵ خلايا / مل في وسط مزرعة يحتوي على 200 ميكروغرام / مل من الهيبارين.
   5. صفيحة 250 ميكرولتر من تعليق الخلية (2.5 × 10⁴ خلايا) لكل بئر في لوحة قاع مسطحة لزراعة الأنسجة 96 بئر.
   6. احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. اليوم 1 - تحضير المجمعات المناعية
   1. قم بإذابة صبغة الأس الهيدروجيني على الثلج.
   2. تحضير 65 ميكرولتر لكل حالة من محلول 500 نانومتر من مجاميع صبغة الأس الهيدروجيني في وسط خال من المصل (SFM) (ارتفاع الجلوكوز DMEM مكمل ب 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 200 ميكروغرام / مل من الهيبارين).
   3. تحضير تخفيفات الأجسام المضادة في 65 ميكرولتر من SFM بتركيز ضعف النهائي. امزج مجاميع صبغة الأس الهيدروجيني والأجسام المضادة في صفيحة قاع 96 بئرا. الحجم النهائي لكل حالة هو الآن 130 ميكرولتر ، وتركيز مجاميع صبغة الأس الهيدروجيني هو 250 نانومتر.
3. اليوم 2 - امتصاص المجمعات المناعية
   1. قم بإزالة وسط الاستزراع من خلايا BV-2. اغسل الخلايا مرة واحدة بدرجة حرارة الغرفة 100 ميكرولتر 1x PBS.
   2. انقل 125 ميكرولتر من المجمعات المناعية إلى الخلايا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان الخلايا مع المجمعات المناعية لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   3. قم بإزالة وسط الحضانة من الخلايا وتخلص منه. اغسل الخلايا مرة واحدة بدرجة حرارة الغرفة 100 ميكرولتر 1x PBS.
   4. قم بإزالة 1x PBS وعالج الخلايا ب 50 ميكرولتر من التربسين-EDTA 0.25٪ لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2.}
   5. أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع وأعد تعليقه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا. انقل الخلايا إلى لوحة قاع على شكل حرف U سعة 96 بئرا. لوحة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   6. ضع الطبق على الثلج ، وقم بإزالة وسط الاستزراع وغسل الخلايا مرتين عن طريق تعليق كريات الخلية في 150 ميكرولتر من الثلج البارد 1x PBS. لوحة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. ضع الخلايا على الجليد ، وقم بإزالة 1x PBS المضاف واغسلها عن طريق تعليق كريات الخلايا في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد (1x PBS ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 2 ملي EDTA). لوحة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   8. ضع الخلايا على الجليد ، وقم بإزالة المخزن المؤقت FACS المضاف وأعد تعليق الخلايا في مخزن FACS البارد 200 ميكرولتر.
   9. قم بتحليل العينات على الفور عن طريق الحصول على أحداث 2 × 10⁴ في بوابة الخلايا الحية (انظر الخطوة 4.1).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا BV-2 مجموعة خط الخلايا بين المختبرات ICLC ATL03001 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1X) جيبكو 10010-015 التربسين EDTA 0.05٪ جيبكو هاتف: 25300-054 DMEM 4.5 جم / ديسيلتر جلوكوز جيبكو 41966-029 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10091-148 البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) جيبكو 15140122 L-جلوتامين 200 ملم لونزا 17-605 [إ] EasYFlask نونك 156499 / 159910 إستر pHrodo Green STP تقنيات الحياة ص 35369 بيكربونات الصوديوم درجة الحموضة 8.5 100 ملي مولار DMSO سيغما D2650-100 مل أعمدة PD10 جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0851-01 مجموعة فحص البروتين BCA ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 23225 لوحات الاستزراع متعددة الآبار Greiner CELLSTAR غرينر 665180 لوحات فحص فالكون 96 جيدا صقر هاتف: 353910 الهيبارين سيغما H3393-50KU تريبسين EDTA 0.25٪ سيغما تي 4049-100 مل جيش صرب البوسنه سيغما إيه 7030-100 جرام EDTA 0.5 ميجا ، درجة الحموضة 8