تقنية لتنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تنتجها خلايا مبيض الهامستر الصينية

الملخص

المصدر: Velugula-Yellela, S.R., et al. تنقية وتحليلات الجسم المضاد وحيد النسيلة من خلايا مبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيولوجي آلي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من سائل زراعة الخلايا الذي يتم حصاده من خلايا مبيض الهامستر الصينية. يستخدم راتينجا زجاجيا مساميا مع بروتين A ثابت ، والذي يرتبط بمنطقة Fc من الأجسام المضادة في العينة ، ويفصلها بشكل فعال عن الملوثات. يؤدي استخدام مخزن مؤقت للشطف منخفض الأس الهيدروجيني إلى إضعاف التفاعل ، مما يسهل استرجاع الأجسام المضادة المنقاة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية الجسم المضاد

ملاحظة: المخزن المؤقت للتوازن للجسم المضاد الداخلي هو 25 ملي مولار تريس ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5. المخزن المؤقت للشطف المستخدم هو 0.1 M حمض الأسيتيك. تعتمد المخازن المؤقتة والراتنج (البروتين أ) على الجسم المضاد المحدد المنقى. حجم العمود يعادل ارتفاع سرير الراتنج. يتم تحديد مقدار المرحلة المتنقلة المستخدمة من حيث حجم العمود.

1. تهيئة نظام التنقية
   1. افتح البرنامج المرفق بنظام التنقية. باستخدام التعليمات اليدوية ، قم بموازنة العمود مع المخزن المؤقت للتوازن بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة لمدة 40 دقيقة. أوقف التشغيل اليدوي بعد التوازن.
   2. في مجمع الكسور ، ضع 15 مل من الأنابيب المخروطية لجمع شطف الأجسام المضادة المنقاة و 50 مل من الأنابيب المخروطية لجمع التدفق أثناء غسل الملح العالي. تأكد من إعادة تعيين مجمع الكسور إلى موضع البداية عن طريق فتح مجمع الكسور وإغلاقه قبل بدء التشغيل. يتم الحفاظ على مجمع الكسر عند 7 درجات مئوية < br / > ملاحظه: يمكن إعادة تعيين مجمع الكسور يدويا ضمن علامة التبويب Fraction Collector في الإعدادات ، لكل من الأنابيب سعة 15 مل و 50 مل.
2. حقن العينة
   ملاحظه: تم الحصول على سائل زراعة الخلايا المحصود المستخدم في الإجراءات التالية من خلايا مبيض الهامستر الصينية المزروعة في المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية.
   1. أضف سائل زراعة خلايا الحصاد المفلتر 0.22 ميكرومتر إلى حقنة فارغة سعة 12 مل يتم تغطية طرف الفوهة.
   2. أمسك المحقنة مع توجيه الفوهة لأسفل ، أدخل مكبس المحقنة حتى يدخل جزء صغير من المكبس. تأكد من عدم تسرب السائل ، أدر المحقنة بحيث تكون الفوهة متجهة لأعلى وقم بإزالة الغطاء.
   3. لا تزال تمسك المحقنة بحيث تكون الفوهة متجهة لأعلى ، ادفع الأسطوانة لتبديد أي هواء حتى يصبح سائل زراعة الخلايا في طرف الفوهة. أدخل فوهة المحقنة في منفذ الحقن اليدوي في نظام التنقية ولفها لتشديدها.
   4. اضغط على المكبس لأسفل حتى يتم حقن كل العينة وتكون مرئية في حلقة العينة ذات الحجم الكبير 10 مل المرفقة.
   5. افتح ملف الطريقة المحفوظة. احفظ ملف النتائج في الموقع المطلوب وحدد اسم الملف عند مطالبتك بذلك. اضغط على تشغيل بعد حقن العينة في حلقة عينة الحجم الكبير.
3. تشغيل طريقة التنقية
   1. حدد الطريقة المحفوظة وانقر فوق تشغيل عندما يطلب منك برنامج الأداة (الخطوة 1.2.5).
      ملاحظه: تم إعداد النظام لتشغيل الخطوات التالية. لا يحتاج المستخدم إلى فعل أي شيء أثناء تشغيل الجهاز.
   2. قم بموازنة العمود بثلاثة أحجام أعمدة (CVs) من المخزن المؤقت للتوازن بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة. بمجرد أن يتم موازنة العمود ، سيقوم النظام ، باستخدام حلقة العينة ذات الحجم الكبير ، بحقن العينة على العمود بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
   يشير
   3. الانخفاض في إشارة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر إلى أن العينة قد انتهت من تحميلها. اغسل العمود بمخزن مؤقت للتوازن بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة حتى تنخفض إشارة الأشعة فوق البنفسجية إلى أقل من 25 مللي أمبير.
   4. استخدم أربع سيرة ذاتية بحجم 25 ملي تريس مع 1 م كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.5 لإجراء غسيل ثانوي عالي الملح بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة. سيجمع مجمع جزء النظام أي بروتين / حمض نووي يخرج من العمود أثناء غسل الملح في أنابيب سعة 50 مل.
   5. قم بتطبيق خمس سيرة ذاتية من المخزن المؤقت للشطف بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة لإزالة الجسم المضاد من العمود. اجمع الشطف في أنابيب سعة 15 مل بناء على إشارة الأشعة فوق البنفسجية ؛ عندما تكون إشارة الأشعة فوق البنفسجية 280 أعلى من 35 مللي أمبير ، يبدأ التجميع ؛ ينتهي التجميع عندما تنخفض الإشارة إلى أقل من 50 مللي أمبير ؛ وهذا ما يسمى ذروة القطع.
      ملاحظه: يضمن قطع الذروة تطبيع ملامح الشطف وتجنب مخلفات ذروة الشطف التي قد تحتوي على مجاميع البروتين.
   6. اغسل العمود باستخدام ثلاث سيرة ذاتية من المخزن المؤقت للتوازن. ينتهي الجري بعد خطوة الغسيل.
   7. بعد الشطف ، قم بتحييد البروتين المنقى على الفور باستخدام قاعدة 1 M Tris إلى درجة حموضة ~ 5.5. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية المرئية عند 280 نانومتر و 260 نانومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط خلية CHO DG44 إنفيتروجين A1100001 أكتا أفانت 25 جنرال إلكتريك لعلوم الحياة 28930842 برو سبتمبر vA راتنج كروماتوغرافيا فائق ميليبور سيجما 115115830 مرحلة تنقية ثابتة عمود Omnifit 10 سم ديبا سوائل إنتذكال 006EZ-06-10-AA السكن للمرحلة الثابتة قاعدة تريس فيشر ساينتيك بي ت 154-1 Superloop 10 مل جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 18-1113-81 μDawn كاشف تشتت الضوء متعدد الزوايا ويات WUDAWN-01 0.22 ميكرومتر Millex GV وحدة تصفية غشاء PVDF ميرك ميليبور SLGV033RB 10X فوسفات محلول ملحي مخزن كورنينج 46-013 سم حقنة 12 مل كوفيديان 8881512878 50 مل أنبوب فالكون شركة كورنينج 352070 96 بئر لوحة بيو راد 127737 حمض الخليك سيجما ألدريتش 695072 مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra-4 100 kDa ميرك ميليبور UFC810096 معيار الأحماض الأمينية ، 1 نانومول / ميكرولتر تقنيات Agilent 5061-3330 مكمل الأحماض الأمينية تقنيات Agilent 5062-2478 محلول فورمات الأمونيوم - تحليل الجليكان شركة ووترز 186007081 أغطية المسمار الزرقاء مع الحاجز تقنيات Agilent 5182-0717 ماء الكروماتوغرافيا (درجة MS) فيشر للكيماويات [و6-4] حمض الهيدروكلوريك فيشر ساينتيك أ 144-500 معيار فحص كتلة mAb سليم شركة ووترز 186006552 عمود الأحماض الأمينية إنترادا 150 × 2 مم إمتكت وا25 مقياس الطيف الضوئي NanoDrop One Microvolume UV-Vis ثيرمو فيشر العلمي 840274100