اختبار للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية في المصل البشري باستخدام مزرعة الخلايا العصبية في الحصين

الملخص

المصدر: Cunquero ، M. ، et al. الثقافات العصبية للحصين لاكتشاف ودراسة الأجسام المضادة المسببة للأمراض الجديدة المشاركة في التهاب الدماغ المناعي الذاتي. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتحديد الأجسام المضادة ضد مستضدات معينة في عينة باستخدام مزرعة عصبية الحصين للفئران. من خلال تعريض الخلايا العصبية المستنبتة لعينات المرضى التي تحتوي على أجسام مضادة ذاتية تستهدف مستقبلات N-Methyl-D-aspartate (NMDARs) ، يتم الكشف عن وجود الأجسام المضادة الذاتية المرتبطة بسطح الخلايا العصبية من خلال التلوين المناعي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

الجزء 1: إنشاء الثقافات العصبية المنفصلة والجنينية والقوارض

1. الخطوات التحضيرية

1. طلاء Poly-L-Lysine (PLL) لأسطح الطلاء (3 أيام قبل التشريح)
   1. تحضير عازلة البورات بإضافة 2.38 جم من حمض البوريك و 1.27 جم من البوراكس إلى 500 مل من الماء المقطر مع التحريك لمدة 15 دقيقة حتى يذوب. تحت غطاء المحرك ، قم بتعقيم المحلول العازل عن طريق الترشيح (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، والملصق ، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظه: هذا الحل مستقر ويمكن استخدامه لمدة 6 أشهر.
      تنبيه: عند تحضير المخزن المؤقت للبورات ، ارتد معدات الحماية الشخصية الموصى بها.
   2. تحضير محلول مخزون PLL (100 مجم / مل) عن طريق إضافة 1 جم من PLL إلى 10 مل من الماء المقطر مع التقليب حتى يذوب. قم بإعداد 500 ميكرولتر من محلول مخزون PLL. للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 مجم / مل ، أضف 500 ميكرولتر من كمية PLL إلى 50 مل من محلول البورات وقم بتحريكه حتى يذوب ، وقم بتعقيم المحلول عن طريق الترشيح (حجم المسام 0.2 ميكرومتر).
      ملاحظه: هذا الحل مستقر ويمكن استخدامه لمدة 6 أشهر.
   3. تحضير الأسطح للطلاء. استخدم أغطية قطرها 12 مم لإجراءات التلوين المناعي وأطباق ذات قاع زجاجي للدراسات التي ستشمل تصوير الخلايا العصبية الحية. في حالة استخدام أغطية ، قم بالأوتوكلاف ثم ضع خمس أغطية في كل طبق (قطر 3.5 سم).
      ملاحظه: يؤثر سمك الغطاء على جودة وشدة إشارة الصور المكتسبة. تم تصميم معظم أهداف المجهر ل # 1.5 أغطية. اختر أغطية الغطاء المناسبة وفقا لإعداد التصوير وتقنياته.
   4. تحت غطاء ، أضف 1.5 مل من محلول PLL إلى كل طبق (طبق ذو قاع زجاجي أو طبق 3.5 سم مع خمسة أغطية). تأكد من غمر جميع أغطية الغطاء وتخزينها في RT لمدة 24 ساعة.
   5. قبل يومين من التشريح ، قم بشفط محلول PLL واغسله بالماء المعقم الخالي من السموم الداخلية ، مع التأكد من غمر الغطاء. احتفظ بالماء في الأطباق واحفظه في RT لمدة 24 ساعة.
   6. قبل يوم واحد من التشريح ، قم بشفط الماء واستبدله بوسائط استزراع NB + B27 (انظر أدناه) ، وضع الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
2. تحضير وسائط الاستزراع ومحلول المخزون (1 يوم قبل التشريح)
   1. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): إلى 500 مل من الجلوكوز العالي DMEM (4.5 جم / لتر) بدون L-Glutamine و الفينول الأحمر ، أضف 50 مل من مصل الحصان ، و 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 10 مل من L-glutamine (200 مل) ، و 10 مل من بيروفات الصوديوم (100 مل) ، و 10 مل من البنسلين والستربتومايسين (10,000 وحدة / مل). قم بالتصفية (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) وتخزينها في 5 مل من الحصص عند 4 درجات مئوية بغطاء مغلق بإحكام.
      ملاحظه: هذا الحل مستقر ويمكن استخدامه لمدة 1 شهر.
   2. وسط Neurobasal (NB) مكمل ب B27 (NB + B27): إلى 50 مل من وسط NB بدون أحمر الفينول ، أضف 1 مل من مكمل B27.
   3. وسط السبات E المكمل ب B27 (السبات + B27): إلى 50 مل من وسط السبات E ، أضف 1 مل من مكمل B27.
   4. الحل الفسيولوجي خارج الخلية (EPS): إلى 1 لتر من الماء المعقم ، أضف ما يلي بالتركيزات النهائية المحددة: كلوريد الصوديوم (140 مليمتر) ، KCl (3.5 مليمتر) ، N- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-N ′- (2-حمض إيثان سلفونيك) (HEPES ، 10 مليمتر) ، الجلوكوز (20 مليمتر) ، وكلوريد_{الكالسيوم 2} (2 مليمتر). قلبي حتى يذوب واضبطي الرقم الهيدروجيني على 7.4 عن طريق إضافة هيدروكسيد الصوديوم (0.5 م) أو حمض الهيدروكلوريك (0.5 م). تحت الغطاء ، قم بالتعقيم عن طريق الترشيح (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. المعدات والمواد المختبرية الأخرى (يوم التشريح)
   1. اضبط الحمام المائي على 37 درجة مئوية ، قم بتسخين الكميات التالية: 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ، و 5 مل من DMEM.
   2. قم بتعقيم الأدوات التالية عن طريق الغمر في دورق يحتوي على الإيثانول المطلق (الشكل 1 ب): ملقط ، ملقط منحني ، مقص ، ملقط منحني ناعما ، ملقط مستقيم ناعم ، مقص جراحة ، ملقط بزاوية دقيقة ، ومقص زنبركي دقيق><. ملاحظه: لحماية الأدوات ، ضع مادة ناعمة (على سبيل المثال ، مناديل علمية دقيقة) في الجزء السفلي من الدورق
   3. املأ صينيتين بالثلج وضع العناصر التالية.
      1. صينية الثلج 1 (الشكل 1 ج): ضع الأدوات الجراحية في الدورق مع الإيثانول المطلق ، ودورق مع HBSS لشطف الأدوات الجراحية ، وطبق 10 سم مع HBSS لوضع الأجنة ، وطبق 6 سم مع HBSS لوضع رؤوس الأجنة ، وطبق 6 سم مع Hibernate + B27 لوضع أدمغة الأجنة.
      2. صينية الثلج 2: ضع 1 مل من التربسين 2.5٪ وطبق 3.5 سم مع السبات + B27 للحصين المقطع.
         ملاحظه: يعتمد الوقت اللازم لهذا الإجراء على خبرة المحقق وعدد الأجنة المراد تشريحها. لذلك ، يجب أن يظل الجليد مجمدا للفترة الزمنية المطلوبة. يوصى باستخدام صواني البوليسترين لهذا الغرض.

< p class = "jove_title" >2. التشريح والبذر (الشكل 1)

1. عزل الحصين
   ملاحظه: يتم القتل الرحيم للفئران الحوامل التي لديها أجنة في اليوم الجنيني 18 (E18) مباشرة قبل بدء البروتوكول وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية لجامعة برشلونة ، وفقا للوائح الأوروبية (2010/63 / UE) حول استخدام التجارب ورعايتها. في هذا البروتوكول ، تم استخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂) كطريقة للقتل الرحيم.
   1. تشريح الفئران على مستوى الصفاق البطني باستخدام الملقط والمقص. استخرج الرحم مع أجنة E18 وضعها في طبق 10 سم تم تبريده على الثلج.
      ملاحظة: من المهم تجنب التصاق شعر الفئران بالأجنة. يوصى باستخدام كميات وفيرة من 70٪ من الإيثانول لتعقيم البطن. من هذه الخطوة فصاعدا ، اعمل داخل غطاء المحرك على صينية الثلج 1.
   2. افتح الأكياس الجنينية وانقل الأجنة إلى طبق 10 سم مع HBSS ، مع التأكد من غمر الأجنة بالكامل.
   3. قم بإزالة رأس الجنين بالمقص وضعه في طبق 6 سم مع HBSS. كرر هذه العملية مع جميع الأجنة.
      ملاحظه: لتجنب التلوث ، يجب التخلص من جميع الأنسجة باستثناء رؤوس الأجنة في وعاء به غطاء لولبي.
   4. أمسك رأس الجنين بملقط منحني بدقة واثقب المدارات بزوج من الملقط المستقيم الدقيق ، والدخول بزاوية 45 درجة ، ثم حرر الملقط المنحني الدقيق.
      ملاحظه: يجب ألا تمر الملقط عبر الدماغ ، لذلك من المهم الحفاظ على الزاوية عند الدخول.
   5. قم بتشريح الجلد والجمجمة بمقص الجراحة، بدءا من العظم القذالي إلى العظم الأمامي. قم بإزالة الدماغ بزوج من الملقط المنحني الدقيق وضعه في طبق 6 سم مع Hibernate + B27. كرر هذه العملية حتى يتم استرداد جميع الأدمغة.
   6. افصل السهمية عن الدماغ باستخدام الملقط المستقيم الدقيق.
      ملاحظه: من هذه الخطوة فصاعدا ، يتم تشريح الحصين تحت مجهر مجسم. يوصى باستخدام المصابيح المفصلية بحيث يضيء الضوء سطح التشريح من الجانبين. يوصى أيضا باستخدام خلفية سوداء لأن هذا يوفر مزيدا من التباين ، مما يسمح بتمييز الحصين بشكل أفضل.
   7. قم بإعداد طبق بحجم 10 سم عن طريق وضع قطرات من Hibernate + B27 على مسافات 1 سم (على سبيل المثال ، في دائرة). ضع تيلنسفالون واحد لكل قطرة من السبات + B27 وتصور من خلال نطاق التشريح (يوصى بتكبير موضوعي بمقدار 1.25 ضعفا).
   8. قشر السحايا بعناية وقم بإزالة المهاد لتصور الحصين بشكل أفضل.
   9. قم بتشريح الحصين بمقص الزنبرك الدقيق وضعه في طبق 3.5 سم مع Hibernate + B27 في صينية الثلج 2. كرر ذلك لكل تيلينسفالون حتى يتم جمع كل الحصين.
   10. اجمع كل الحصين بعناية باستخدام ماصة باستور وانقلها إلى أنبوب سعة 50 مل.
       ملاحظه: خذ الحد الأدنى لحجم السبات + B27 عند جمع الحصين حتى لا يخفف التربسين.
2. تفكك الخلية
   1. التفكك الأنزيمي للحصين
      1. في الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على الحصين ، أضف 1 مل من 2.5٪ التربسين واجعله يصل إلى حجم 5 مل مع HBSS. احتضن لمدة 15 دقيقة في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية.
      2. لتخفيف التربسين ، أضف 10 مل من HBSS المسخن مسبقا واحتضانه لمدة 5 دقائق في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية.
      3. انقل الحصين الذي يظهر الآن ككتلة مخاطية إلى أنبوب سعة 50 مل مع ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر ، وأضف 6 مل من HBSS المسخن مسبقا ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية.
   2. التفكك الميكانيكي للحصين
      1. انقل الكتلة إلى أنبوب سعة 2 مل بقاع مخروطي الشكل ، مع أخذ الحد الأدنى من الحجم. أضف 1 مل من وسائط DMEM المسخنة مسبقا. قم بتجانس الحبيبات باستخدام ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر عن طريق الشفط برفق لأعلى ولأسفل.
         ملاحظه: من الأهمية بمكان تجنب توليد الفقاعات عند الشفط لأن الفقاعات قد تحلل الخلايا.
      2. كرر الشفط لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة مسبقا (10x-20x)، مع ملامسة طرفها للقاع المخروطي للأنبوب. تجنب توليد الفقاعات. في نهاية هذه الخطوة ، يجب أن يكون الخليط شفافا.
      3. بمجرد خلطه بشكل متجانس بحيث يكون الخليط شفافا ، انقل الخليط إلى أنبوب يحتوي على 4 مل من وسائط DMEM عند 37 درجة مئوية وتجانسه بماصة زجاجية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
3. بذر الخلايا
   1. عد الخلايا. يمكن حساب عدد الخلايا العصبية في المحلول وفقا للإجراءات المعملية القياسية.
      ملاحظه: في تجارب التصوير للكشف عن الأجسام المضادة ونشاط الكالسيوم ، يكون تركيز 50.000 خلية لكل طبق 3.5 سم هو الأمثل.
   2. إبقاء الخلايا معلقة ، وسحب الحجم المحسوب ، والطبق في أطباق 3.5 سم تحتوي على أغطية مطلية ب PLL أو في أطباق القاع الزجاجي المطلية ب PLL.
   3. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي على الأطباق عن طريق الرج برفق في حركات متقاطعة (ذهابا وإيابا ، ثم جنبا إلى جنب ؛ كرر حسب الحاجة) وضع الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪><). ملاحظه: من المهم استخدام الحركات المتقاطعة لتجنب استقرار الخلايا في محيط الطبق.
   4. كل أسبوع ، أضف ما يقرب من 1 مل من NB + B27 ، حتى لا تجف المزرعة.
      ملاحظه: بعد أسبوعين (14 يوما في المختبر [div]) ، تصبح الخلايا العصبية ناضجة وتعبر عن جميع العوامل التي سيتم استخدامها للتجريب. يبلغ المتوسط الإجمالي لعدد الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول حوالي 2.5 × 10⁶ خلايا عصبية قادمة من متوسط 12 جنينا E18 لكل فأر حامل.

فئة

الجزء 2: استخدام المزارع العصبية الحصين للكشف عن الأجسام المضادة في بروتينات سطح الخلية العصبية

< p class = "jove_content" >

ملاحظة: يوضح هذا الجزء من البروتوكول كيفية استخدام مزارع الحصين لتحديد الأجسام المضادة ل NMDAR في المصل و / أو السائل الدماغي النخاعي للمرضى الذين يعانون من التهاب الدماغ المضاد ل NMDAR. يستخدم التلوين المناعي الفلوري لتصور التفاعل في الخلايا العصبية الحية ، ولكن يمكن أيضا استخدام طرق تصور أخرى. سيكون التحكم المناسب لهذه التجربة هو المصل أو السائل الدماغي النخاعي من فرد سليم. عند استخدام عينات بشرية ، ضع في اعتبارك أنه قد تكون هناك حاجة إلى موافقة اللجنة الأخلاقية المؤسسية.

فئة

3. تلطيخ مناعي الفلورسنت الحي

1. استخدم 14 خلية div نمت على أغطية (50,000 خلية لكل طبق 3.5 سم يحتوي على خمس أغطية).
2. داخل الشفاط ، اشطف الغطاء باستخدام NB المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
3. أضف العينة التي تحتوي في هذه الحالة على أجسام مضادة مضادة ل NMDAR (تستخدم كجسم مضاد أساسي) مخففة في وسائط NB عند 1: 200 للمصل أو 1: 2 للنخاع الدماغي النخاعي واحتضان ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪).
4. اشطفه بعناية باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 3x عند RT.
5. أضف محلول التثبيت (4٪ فورمالديهايد في PBS) واحتضنه في RT لمدة 5 دقائق
   أنذر: عند التعامل مع 4٪ فورمالديهايد ، اعمل داخل غطاء المحرك وارتد معدات الحماية الشخصية الموصى بها.
6. اغسل 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
7. أضف الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للإنسان AF488 عند تخفيف 1: 1000 واحتضانه في RT لمدة 1 ساعة < / > ملاحظه: أثناء الحضانة ، احم من التعرض للضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم.
8. اغسل 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. اشطفه بالماء المقطر
9. قم بتركيب الغطاء بوسيط تركيب سائل (على سبيل المثال ، وسائط التثبيت المضادة للبهتان مع DAPI ؛ حوالي 7 ميكرولتر) ، واستنشق أي سائل متبقي واشطفه بالماء المقطر. الخلايا العصبية جاهزة الآن للتصوير الفلوري.
   أنذر: عند التعامل مع وسط التركيب ، ارتد معدات الحماية الشخصية الموصى بها.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: بروتوكول بصري للثقافات الأولية للخلايا العصبية في الحصين. (أ) مخطط انسيابي يوضح الأجزاء الثلاثة من البروتوكول لإعداد مزارع الخلايا المنفصلة للخلايا العصبية في الحصين من الفئران الجنينية في E18. ينقسم البروتوكول إلى 1. عزلة الحصين ، 2. تفكك الخلايا ، و 3. بذر الخلايا. (ب) اختيار الأدوات الموصى بها لعزل الحصين مجمعة في ثلاث فئات: (1- ملقط ، 2- ملقط ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 سم صحن زراعة الخلايا نونك 12-565-020 أغطية مستديرة 12 مم صياد NC9708845 20x NA 0.75 S هدف الهواء الفلوري نيكون سي إف آي سوبر فلور 20X 3.5 سم طبق زراعة الخلايا نونك 12-565-90 طبق ثقافة الخلية 6 سم نونك 12-565-94 مكمل B27 جيبكو 17504-044 دورق 100 مل بيريكس - بورق سيجما ألدريتش ب 9876 حمض البوريك سيجما ألدريتش ب 0252 ملقط منحني FST 11009-13 د-جلوكوز سيجما ألدريتش د9434 DMEM عالي الجلوكوز (4.5 جم / لتر) ، بدون L-Glutamine ، بدون فينول أحمر الجدي DMEM-HXRXA أنثى فأر ويستار (حامل 18 يوما) جانفيير - مصل الأبقار الجنينية (FBS) الغرب الحيوي إس 181 ب -500 ملقط بزاوية دقيقة FST 11251-35 ملقط منحني ناعم FST 11272-30 ملقط مستقيم دقيق FST 11251-23 مكعب مرشح FITC نيكون السلسلة القياسية ملقط FST 11000-12 الماعز المضاد للإنسان AF488 إنفيتروجين أ 11013 HBSS الجدي HBSS-1A هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 السبات E المتوسطة جيبكو أ12476-01 مصل الحصان (HS) ثيرموفيشر 26050088 الجسم المضاد البشري المضاد ل NMDAR (CSF) عينة المريض - الأجسام المضادة البشرية المضادة ل NMDAR (المصل) عينة المريض - ImageJ / فيجي المؤسسه الإصدار 1.50i مجهر مضان مقلوب نيكون كسوف TE2000-U محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو 10010023 بولي ليسين (PLL) الببتيد الدولي موافق الموافق - 35056 صينية ثلج البوليسترين - - مقص زنبركي دقيق FST 15000-08 إطالة الذهب مع DAPI (وسائط تركيب مضادة للبهتان) المجسات الجزيئية ص36941 مقص FST 14068-12 بيروفات الصوديوم الغرب الحيوي L0642-100 مجهر ستيريو زييس ستيمي 2000 مقص الجراحة FST 14081-09 التربسين 2.5٪ جيبكو 15090046 ماء ، خالي من السموم الداخلية المعقمة سيجما ألدريتش W3500