اختبار لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالفيروس المخلوي التنفسي

الملخص

المصدر: Do ، L. A. H. ، وآخرون ، مقايسة تحييد دقيق للفيروس المخلوي التنفسي (RSV) محسن وعالي الإنتاجية.J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الأجسام المضادة المعادلة ضد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV). يؤدي الحضانة المسبقة بمصل الدم الذي يحتوي على الأجسام المضادة المعادلة لفيروس RSV إلى تحييد جزيئات الفيروس ، مما يقلل من العدوى الخلوية وتكوين البلاك. ثم تخضع الخلايا المصابة بالفيروس للتثبيت والحجب ووضع العلامات على الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور لتصور البلاك. تتيح هذه العملية تحديد أعلى تخفيف في المصل يحيد خمسين بالمائة من RSV ، وهو ما يمثل عيار التحييد.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء محرك BSL2 ما لم ينص على خلاف ذلك. يلزم إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي قبل اختبار تحييد تقليل البلاك (PRN) لتحديد التركيز الأمثل لمقاومة الفيروس RSV المستخدم في مقايسة PRN. يوصى بتقسيم مخزونات الفيروس بحجم صغير يتم إذابته مرة واحدة واستخدامه لكل مقايسة NAb. يوصى أيضا باستخدام نفس المخزون الفيروسي لجميع فحوصات NAb التي يتم إجراؤها لجميع العينات من دراسة واحدة. تأكد من تسخين وسائط الاستزراع والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) عند 37 درجة مئوية قبل إضافتها إلى ألواح الخلايا.

1. المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي RSV

ملاحظة: اعتمادا على عدد مخزونات الفيروسات وعدد التكرارات ، يمكن إعداد لوحة الفحص وفقا للشكل 1. يجب معايرة كل مخزون من الفيروسات ثلاث نسخ أسفل لوحة الفحص ، بدءا من أعلى تركيز فيروسي (أي 1:10). يمكن أن تكون المعايرة بالتحليل الحجمي التسلسلي عادة 1:10. تتم إجراءات زراعة الخلايا A549 وصيانتها وزراعة RSV باستخدام إجراءات قياسية ولا يتم تضمينها في هذا البروتوكول.

1. لوحات البذر (اليوم 1)
   1. قم بتعليق خلايا A549 في وسط النسور المعدلة من Dulbecco (DMEM) + 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) + 1000 وحدة دولية من البنسلين / الستربتومايسين (القلم / البكتيريا) عند 4 × 10⁵ / مل. بذرة 96 بئر ألواح معقمة مسطحة القاع مع 100 ميكرولتر / بئر تحتوي على 4 × 10⁴ خلايا A459.
   2. احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) (ستكون الخلايا في مرحلة نمو اللوغاريتم).
      ملاحظه: استخدم قارورة خلية A549 جديدة بعد 23 مقطعا. يوصى بعدم بدء التجارب عندما تكون قارورة خلية جديدة لا تزال في الممرات الثلاثة الأولى.
2. عدوى الفيروس (اليوم 2)
   1. تحضير التخفيف التسلسلي للفيروس
      1. قم بإذابة قارورة واحدة مجمدة من الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما تقريبا وتوضع على الفور على الجليد. قم بإعداد 3 نسخ مكررة لكل مخزون من فيروس RSV المراد فحصه ، واستخدم تخفيفا أوليا لمخزون الفيروسات بنسبة 1:10 مع 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف / البئر ، واحتفظ بعمود واحد على الأقل للتحكم السلبي. < / > ملاحظة: يوضح الشكل 1 التحكم السلبي في النسخ الثلاثية.
      2. أضف 100 ميكرولتر من كل فيروس مخفف عند 1:10 في ثلاث نسخ من الصف A من صفيحة معقمة ذات قاع U 96 بئرا. أضف 90 ميكرولتر / بئر من DMEM + 1000 وحدة دولية قلم / بكتيريا عقدية بدون FCS إلى الصفوف B إلى H.
      3. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 1:10 أسفل اللوحة عن طريق نقل 10 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B. امزج المحلول عن طريق سحب المحتوى لأعلى ولأسفل 5 مرات واستمر في التخفيفات العشرة أضعاف حتى الصف H. تخلص من 10 ميكرولتر الأخيرة بحيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 90 ميكرولتر
         ملاحظة: من المهم استخدام نصائح جديدة لكل تخفيف.
   2. تلقيح الفيروس لخلايا A549
      1. استرجع لوحة (صفائح) الخلية A549 المعدة في اليوم السابق. تأكد من أن الطبقات الأحادية للخلية A549 في الألواح المكونة من 96 بئرا ~ 80٪ ملتقية. تخلص من الوسائط عن طريق قلب اللوحة برفق ونشفها برفق على منشفة ورقية ماصة معقمة.
      2. اغسل جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من PBS مرتين ؛ تخلص من PBS الزائد عن طريق قلب اللوحة برفق والنشاف برفق على منشفة ورقية ماصة معقمة بعد كل غسلة. لا تدع الأطباق تجف.
      3. انقل تخفيفات الفيروس من لوحة المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي (الشكل 1) إلى الآبار المقابلة على لوحة الخلية A549. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. بعد 1 ساعة من الحضانة ، صب المواد الطفية باستخدام ماصة (لتجنب التلوث المتبادل). أخرج 90 ميكرولتر / بئر.
      4. أضف 100 ميكرولتر من 1x متوسط 199 (M199 ، انظر جدول المواد) + 1.5٪ كربوكسي ميثيل سلولوز ملح الصوديوم (CMC) منخفض اللزوجة + 2٪ FCS يحتوي على قلم / بكتيريا إلى كل بئر. < / > ملاحظة: يجب تحضير محاليل 2x M199 + 4٪ FCS + 2٪ قلم/بكتيريا و3٪ CMC وتخزينها عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. تأكد من تسخين المحلول عند 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الأطباق.
         1. تحضير 2x محلول M199: 1 كيس / 500 مل ماء مقطر + 20 مل FCS + 10 مل قلم / بكتيريا (لتعويض 2x MI99). قم بتصفية المحلول باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر.
         2. لتحضير 3٪ CMC ، أضف 15 جم من CMC ببطء في 500 مل من الماء المقطر. قم بإذابة CMC في الماء باستخدام سخان نمام معدني عند 50 درجة مئوية ، والذي يستغرق حوالي 1 ساعة للتحضير. تخلط جيدا لعمل 3٪ CMC وتعقيم المحلول.
            ملاحظة: يجب إضافة مادة CMC الصلبة إلى الماء المراد إذابته ؛ تؤدي إضافة الماء إلى المادة الصلبة الجافة إلى إنتاج "كتلة" من المواد الصلبة التي يصعب إذابتها.
         3. قم بإعداد 1x M199 + 1.5٪ CMC منخفض اللزوجة + 2٪ FCS يحتوي على قلم / بكتيريا عن طريق خلط 1: 1 2x M199 و 3٪ CMC المحضر في الخطوة 1.2.2.4.2.
      5. احتضان اللوحة لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. تطوير لوحة الفحص والتحليل (اليوم 5)
   1. التثبيت وتطوير لوحة الفحص
      1. تخلص من M199 + CMC + 2٪ FCS يحتوي على قلم/بكتيريا عن طريق قلب اللوحة برفق. أضف ببطء (لتجنب إزعاج طبقة الخلية) 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت (80٪ أسيتون ، 20٪ PBS ، مخزن عند -20 درجة مئوية) لإصلاح الخلايا. احتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      2. تخلص من المخزن المؤقت للتثبيت وامسحه برفق على منشفة ورقية ماصة. اترك الطبق ووجهه لأسفل حتى يجف لمدة 10 دقائق. < / > ملاحظه: من هذه الخطوة فصاعدا ، يمكن إجراء الفحص خارج غطاء محرك BSL2.
      3. قم بإعداد محلول حجب مخفف للحليب بنسبة 5٪ في PBS مفلتر يحتوي على 0.05٪ بولي سوربات 20 (PBS-polysorbate ، انظر جدول المواد). احسب الحجم المطلوب لحجب صفيحة واحدة على أساس 200 / بئر و 110 آبار: 200 ميكرولتر / بئر × 110 آبار = 22 مل (1.1 مل مخفف حليب مركز في 20.9 مل PBS-polysorbate مفلتر). في هذه المرحلة ، قم أيضا بتكوين محلول مانع كاف للأجسام المضادة الأولية والثانوية. احسب الحجم المطلوب لكل محلول أجسام مضادة للوحة واحدة بناء على 50 ميكرولتر / بئر و 110 آبار: 50 ميكرولتر / بئر × 110 آبار = 5.5 مل. لذلك ، فإن الحجم الإجمالي لمحلول حجب الحليب المخفف المطلوب لفحص لوحة واحدة هو 33 مل.
      4. أضف 200 ميكرولتر / بئر من محلول الحظر. احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة. تخلص من المحلول عن طريق قلب اللوحة برفق وصمة عار على منشفة ورقية ماصة.
      5. تحضير 1: 500 Goat X RSV الأجسام المضادة (mAb - الجسم المضاد الأساسي) المخفف في محلول الحظر. أضف 50 ميكرولتر / بئر من محلول mAb واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اغسل الطبق 3 مرات باستخدام PBS-polysorbate المصفى.
      6. قم بإعداد 1: 5,000 Alexa-Fluor Donkey المضاد للماعز IgG (الجسم المضاد الثانوي) المخفف في محلول الحبس. أضف 50 ميكرولتر / بئر من محلول الجسم المضاد الثانوي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل الطبق 5 مرات باستخدام PBS-polysorbate المصفى.
      7. اقرأ اللوحة على قارئ موضعي آلي باستخدام قناة الفلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) وإعدادات العد ، كما هو موضح في الشكل 2. لف اللوحة بورق القصدير واحفظها عند 4 درجات مئوية. قم بمعايرة الجهاز باستخدام لوحة ثقافة 96 بئرا غير مستخدمة وإعدادات عد الإدخال قبل المقايسة.
         ملاحظه: يمكن إعادة المسح الضوئي في غضون أيام قليلة إذا لزم الأمر. يمكن حفظ إعداد المعايرة والعد واستخدامه للمسح الضوئي المستقبلي إذا كان المفحص يستخدم نفس نوع اللوحة المستخدمة للمعايرة.
      8. تحقق من صور الآبار بحثا عن لويحات القطع الأثرية أو الطبقات الأحادية للخلايا المعطلة (الشكل 3). استبعاد الآبار ذات الطبقات أحادية الخلية المعطلة.
         ملاحظه: اعتمادا على حجم اللوحات الأثرية ، قد يلزم إجراء عمليات عد يدوية لتلك الآبار ، أو قد تحتاج هذه الآبار إلى التخلص منها من تحليل البيانات. تشمل معايير النتيجة الصحيحة عدم اكتشاف أي طبقة أحادية الخلية أو لويحات القطع الأثرية المعطلة في أكثر من بئر مكرر واحد وعدم اكتشاف وحدات تشكيل البلاك (PFU) في الآبار السالبة (الآبار التي لا تحتوي على فيروس مضاف).
   2. تحديد تركيزات الفيروس
      1. اختر آخر مخففين حيث يمكن حساب البقع بوضوح. احسب متوسط عدد البقع من الآبار المتكررة في نفس التخفيف. احسب العيار الفيروسي (PFU لكل مل) لعينة المخزون باستخدام الصيغة أدناه:
         PFU / مل = متوسط عدد اللويحات / (عامل التخفيف × حجم الفيروس المخفف المضاف إلى البئر)
         ملاحظه: يمكن الآن استخدام تركيز الفيروس المحدد لكل مخزون من مخزونات RSV في مقايسة PRN (الخطوة 2).

2. فحص تحييد RSV

1. لوحات البذر (اليوم 1)
   1. قم بإعادة تعليق خلايا A549 في DMEM + 10٪ FCS + 1000 وحدة دولية من القلم/البكتيريا العقدية بمعدل 4 × 10⁵/مل. بذور 96 بئر ألواح معقمة مسطحة القاع مع 100 ميكرولتر / بئر تحتوي على 4 × 10⁴ خلايا A459 وتحتضن الألواح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ (ستكون الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمية).
      ملاحظه: استخدم قارورة خلية A549 جديدة بعد 23 مقطعا. لا ينصح باستخدام خلايا A549 قبل المقطع رقم 3.
2. تحضير الفيروسات والمصل (اليوم 2)
   ملاحظه: اعتمادا على نوع العينة ، هناك خطوات مطلوبة للمعالجة المسبقة للعينات قبل مقايسة NAb. يوصى باستخدام الأمصال القياسية الدولية RSV المتوفرة الآن عند الطلب من المعهد الوطني للمعايير والضوابط البيولوجية (NIBSC).
   1. تحضير تخفيف المصل
      1. قم بإذابة المصل المرجعي البشري (المصل المرجعي ، REF) وعينات اختبار المصل في RT. عينات المصل التعطيل الحراري والمصل المرجعي في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. قم بإعداد التخفيفات حسب قالب اللوحة (الشكل 4).
      2. قم بإعداد تخفيف 1: 100 من REF. قم بإعداد ما لا يقل عن 110 ميكرولتر من REF المخفف في DMEM + قلم / بكتيريا بدون FCS لكل لوحة فحص (على سبيل المثال ، 1.5 ميكرولتر من REF بحجم إجمالي قدره 150 ميكرولتر). أضف 110 ميكرولتر من 1: 100 REF المخفف في البئر A12 من صفيحة معقمة ذات قاع U مكون من 96 بئر.
      3. أضف 55 ميكرولتر من DMEM + قلم / بكتيريا بدون FCS إلى الآبار B12 إلى H12 في العمود 12. قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية 1: 2 أسفل اللوحة عن طريق نقل 55 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B ، وخلط المحلول عن طريق سحب المحتوى لأعلى ولأسفل 5 مرات والاستمرار حتى الصف H. تخلص من آخر 55 ميكرولتر من الوسائط بحيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 55 ميكرولتر.
      4. تحضير تخفيف 1:100 من عينات اختبار المصل. نظرا لأن جميع عينات المصل يتم فحصها في ثلاث نسخ ، قم بإعداد حجم لا يقل عن 110 ميكرولتر / بئر × 3 = 330 ميكرولتر لكل عينة اختبار مصل.
      5. أضف 110 ميكرولتر من كل عينة اختبار مصل مخفف (1: 100 ؛ S1 = مصل 1 ، S2 = مصل 2 ، إلخ.) إلى الآبار المقابلة A1 إلى A9 وأيضا E1 إلى E9 من الصفيحة المعقمة المكونة من 96 بئرا وفقا للشكل 4.
      6. أضف 55 ميكرولتر من DMEM + قلم / بكتيريا بدون FCS إلى جميع الآبار المسماة X. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية 1: 2 وفقا للخطوة 2.2.1.3 حتى الصف D (للعينات 1 و 2 و 3). تخلص من آخر 55 ميكرولتر من الوسائط بحيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 55 ميكرولتر. وبالمثل ، قم بإجراء التخفيفات التسلسلية 1: 2 للعينات 4 و 5 و 6 للصفوف E إلى H.
         ملاحظه: من الضروري استخدام نصائح جديدة لكل تخفيف.
      7. أضف 55 ميكرولتر من DMEM + قلم / بكتيريا بدون FCS إلى الآبار في العمودين 10 و 11.
   2. تحضير الفيروس
      1. قم بإذابة قارورة واحدة مجمدة من RSV بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما تقريبا وتوضع على الفور على الجليد.
      2. تمييع الفيروس في DMEM + القلم / البكتيريا العقدية بدون FCS بناء على تركيز حصة RSV المحددة في الخطوة 1.3.2. ضع مخففا يعطي ما يقرب من 200 PFU / بئر. تحضير حجم إجمالي قدره 5.5 مل (ل 100 بئر).
   3. تحضير خليط الفيروسات والمصل
      1. أضف 55 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى جميع آبار الأعمدة 1-9 وآبار الصفوف E-H للعمودين 10 و 11 (التحكم الإيجابي) وفقا لقالب اللوحة (الشكل 4).
      2. أضف 55 ميكرولتر DMEM + قلم / بكتيريا بدون FCS إلى جميع آبار الصفوف A-D للعمودين 10 و 11 (التحكم السلبي). احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   4. تلقيح الفيروس لخلايا A549
      1. قبل الانتهاء من فترة الحضانة ، استرجع لوحة (صفائح) الخلايا A549 المحضرة في الخطوة 2.1.1. تأكد من أن الطبقات الأحادية للخلية A549 في الألواح المكونة من 96 بئرا ~ 80٪ ملتقية.
      2. تخلص من الوسائط عن طريق قلب اللوحة برفق ونشفها برفق على منشفة ورقية ماصة معقمة. اغسل جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من PBS مرتين ، وتخلص من PBS الزائد عن طريق قلب اللوحة برفق والنشاف برفق على منشفة ورقية ماصة معقمة بعد كل غسلة. لا تدع الأطباق تجف.
      3. انقل 100 ميكرولتر / بئر من خليط مصل الفيروس إلى الآبار المقابلة على لوحة الخلية A549 باتباع قالب اللوحة. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      4. بعد ساعة واحدة، باستخدام ماصة، أخرج 90 ميكرولتر/بئر وأضف 100 ميكرولتر من 1x M199 + 1.5٪ CMC + 2٪ FCS + القلم/البكتيريا. احتضان اللوحة لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
         ملاحظه: تأكد من تسخين المحلول عند 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الأطباق.
3. تطوير لوحة الفحص والتحليل (اليوم 5)
   1. تطوير لوحة التثبيت والفحص باتباع الخطوات 1.3.1.1 إلى 1.3.1.8.
   2. تحديد عيار التحييد بنسبة 50٪
      1. حدد عيار التحييد بنسبة 50٪ عن طريق حساب المسافة النسبية بين تخفيفات المصل المتبادلة أعلى وأقل من 50٪ من آبار التحكم "بدون مصل" (المكافحة الإيجابية للفيروس - العمود 10 ، الصفوف E-H).
      2. احسب عدد PFU (أي اللويحات) الناشئة عن الالتهابات الفيروسية الفردية في آبار المصل وعدم وجود آبار التحكم في المصل. احسب متوسط عدد PFU لآبار التحكم في المصل وحدد قيمة 50٪.
      3. تحديد تخفيفات المصل مع التعداد مباشرة أعلى وأقل من قيمة 50٪ من آبار عدم التحكم في المصل. باستخدام رسم بياني شبه لوغاريتمي أو قالب جدول بيانات ، ارسم عدد PFU على المحور x (المقياس الخطي) وتخفيف المصل المتبادل على المحور y (مقياس السجل₁₀). ارسم خطا بين النقطتين واقرأ عيار التحييد بنسبة 50٪ لعينات مصل الاختبار من هذا الخط.

النتائج

الشكل 1: تخطيط لوحة المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي لتحديد كمية مخزون RSV.v = مخزون فيروس RSV (v1 ، مخزون الدفعة الفيروسية 1 ؛ v2 ، مخزون الدفعة الفيروسية 2 ؛ v3 ، مخزون الدفعة الفيروسية 3) ، N = التحكم السلبي جيدا ، X = الوسائط المضافة. الترميز اللوني هو فقط للمساعدة في تصور تخطيط اللوحة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط الخلية أ 549 ATCC CCL-185 مقدم من الدكتور كيث تشابيل ، جامعة كوينزلاند سلالات فيروسية RSV A2 ATCC VR-1540 رقم الدفعة 60430286 الكواشف أسيتون ميرك 1000142511 حمار Alexa-Fluor المضاد للماعز IgG (مخزن في 4 درجات مئوية) تقنيات الحياة أ 11055 مسحوق ملح الصوديوم CMC سيجما ألدريتش سي 5678-500 جرام DMEM (بدون مصل ، 3.7 جم / لتر NaHC ، P / S) (مخزن عند 4 درجات مئوية) الخدمات العلمية – زراعة الأنسجة MCRI في الإمداد المنزلي مصل ربلة الساق الجنينية (مخزن في 50 مل عند -20 درجة مئوية) Interpath SFBS-F الجسم المضاد للماعز X RSV ميرك أ ب 1128 مصل مصل بشري متعدد النسيلة للفيروس المخلوي التنفسي (RSV) (مخزن في 45 ميكرولتر من الحصص عند -20 درجة مئوية) موارد BEI رقم 4022 طلب مجاني من خلال BEI Resources عند التسجيل. ينتمي هذا المصل إلى لوحة من مضاد المصل البشري والجلوبيولين المناعي ل RSV (NR-32832) مسحوق M199 تقنيات الحياة 31100035 محلول حجب مخفف الحليب (مخزن عند 4 درجات مئوية) البحث البيولوجي الأسترالي 50-82-01 البنسلين / الستربتومايسين (مخزن في 6 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية) تقنيات الحياة 15140122 s.d.H2O من موزع Milli-Q ميرك الإعفاء الداخلي معقم 1X PBS للثقافة (مخزن عند 4 درجات مئوية) الخدمات العلمية – زراعة الأنسجة MCRI في الإمداد المنزلي توين 20 بولي سوربات سيجما ألدريتش 9005-64-5 المواد الاستهلاكية العامة أنابيب الصقر المخروطية (50 مل) تقنيات Invitro FAL352070 وحدة الفلتر: 0.22 ميكرومتر (500 مل) ثيرمو فيشر NAL5660020 أنابيب Eppendorf المعقمة (1.5 مل) أستراليا PL AM12400 ألواح معقمة ذات قاع مسطح (96 بئر مع غطاء) Interpath 655180 ألواح معقمة على شكل حرف U (96 بئر مع غطاء) Interpath 650180 ماصة مصلية سعة 5 مل سيجما ألدريتش CLS4487-200 أ ماصة مصلية سعة 10 مل Interpath 607180 25 مل ماصة مصلية سيجما ألدريتش CLS4251-200 إيه ماصة تلميح 1-200 ميكرولتر شفاف Maxymum Recovery بأرفف معقمة مسبقا 10 رفوف × 96 نصائح PKG960 فيشر بيوتيك تي إف 200 إل آر إس طرف ماصة 5-20 ميكرولتر Clear Maxymum Recovery Racked 10RACKS x 96TIPS PKG960 فيشر بيوتيك TF-20-L-R-S ماصة تلميح 100-1000 ميكرو لتر ماكسيموم الاسترداد بأرفوف معقمة مسبقا 10 رفوف × 100 أطراف PKG1000 فيشر بيوتيك TF-1000-LRS طرف ماصة 1-10 ميكرولتر شفاف Maxymum Recovery أرفف معقمة مسبقا 10RACKS × 100TIPS PKG1001 فيشر بيوتيك TXLF-10-L-R-S المعدات والبرمجيات نظام قارئ ELISpot AID iSpot ، Autoimmun Diagnostika GmbH ، ستراسبورغ ، ألمانيا برنامج AID ELISpot الإصدار 5.0 AID iSpot ، Autoimmun Diagnostika GmbH ، ستراسبورغ ، ألمانيا مايكروسوفت إكسل 2007