الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة البشرية باستخدام مقايسة التلألؤ الكهربي

الملخص

المصدر: Gu ، Y. et al. ، فحوصات التلألؤ الكهروكيميائي للأجسام المضادة الذاتية للجزيرة البشرية.J. Vis. Exp. (2018)

يعرض هذا الفيديو الكشف عن التلألؤ الكهربي للأجسام المضادة الذاتية للجزر في المصل البشري. تربط الأجسام المضادة الموجودة في المصل المستضد المترافق بالروثينيوم بمستضد الالتقاط البيوتينيل ، وتشكل مجمعات يتم اكتشافها عن طريق قياسات التلألؤ الكيميائي الكهربائي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. إعداد المخزن

المؤقت

1. المخزن المؤقت لوضع العلامات (2x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، (PBS) ، درجة الحموضة 7.9): في 400 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات (DD) ، أضف 100 مل من 10x PBS ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.9 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
2. 3 ملي مولار من البيوتين: قم بإذابة 1 مجم من البيوتين في 588 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات.
3. 3 ملي مولار من علامة السلفو: قم بإذابة 150 نانومول من علامة السلفو في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات.
4. عازلة المستضد (5٪ BSA): في 500 مل من 1x PBS ، أضف 25 جم من ألبومين مصل البقر (BSA).
5. تحضير محلول حمض الأسيتيك 0.5 م.
6. 1.0 متر من الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت Tris-HCl 9.0: قم بإعداد 1 M Tris-HCl المؤقت ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 9.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
7. المخزن المؤقت للطلاء (3٪ مانع أ): في 500 مل من 1x PBS ، أضف 15 جم من الحاجز A.
8. مخزن الغسيل المؤقت (0.05٪ Tween 20 ، PBST): في 5000 مل من 1x PBS ، أضف 2.5 مل من Tween 20.
9. المخزن المؤقت للقراءة (2x قراءة العازلة T مع الفاعل بالسطح): في 500 مل من ماء DD ، أضف 500 مل من 4x Read Buffer T مع الفاعل بالسطح (جدول المواد).
10. قم بتخزين البيوتين والسلفو في فريزر -20 درجة مئوية.
    ملاحظه: يجب دائما تحضير كل من محاليل البيوتين والسلفو طازجة قبل إجراء وضع العلامات مباشرة.

2. قم بتسمية المستضد الذاتي للجزيرة البشرية بعلامة البيوتين والسلفو

ملاحظة: يوصى بتركيز عال من المستضد ، ≥0.5 مجم / مل ، لتفاعل وضع العلامات الأكثر كفاءة.

1. تحديد النسبة المولية للمستضد الذاتي للجزيرة البشرية للبيوتين والسلفو.
   1. احصل على الرقم المولي للمستضد بقسمة وزن المستضد على الوزن الجزيئي.
   2. استخدم النسبة المولية 1: 5 للمستضد ذو الوزن الجزيئي الأصغر (≤10 كيلو دالتون) ، والنسبة المولية 1:20 للمستضد ذو الوزن الجزيئي الأكبر (>50 كيلو دالتون).
   3. احسب حجم البيوتين أو السلفو بقسمة الرقم المولي على تركيزه.
2. امزج المستضد الذاتي للجزيرة البشرية مع البيوتين أو السلفو مع النسبة المولية 1: 5.
   ملاحظه: يجب استبدال البروتين في أنظمة المخزن المؤقت tris أو glycine إلى 2x PBS buffer مع درجة الحموضة 7.9 باستخدام عمود دوران التحجيم.
3. نظرا لأن البيوتين والسلفو حساسان للضوء ، فقم بتغطية أنابيب التفاعل بورق الألمنيوم. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
4. أثناء الحضانة ، قم بتجهيز عمود الدوران عن طريق الاستغناء عن 2x PBS buffer في العمود ثلاث مرات. الطرد المركزي المحلول عند 1000 × جم لمدة دقيقتين في كل مرة.
   ملاحظه: في الوقت الحالي ، لا يزال تفاعل الملصقات ، من خلال التجسير ، يحدث ويجب إيقافه.
5. أوقف تفاعل الملصقات عن طريق تنقية المستضد الذاتي للجزيرة البشرية المسمى. للتنقية ، قم بتمرير المستضد الذاتي عبر عمود الدوران وقم بالطرد المركزي للعمود عند 1000 × جم لمدة دقيقتين.
6. حدد تركيز المستضد المسمى (ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام كمية بروتين المستضد والحجم النهائي. < / > ملاحظه: تقريبا ، سيكون هناك احتفاظ بنسبة 90-95٪ بالمستضد المسمى بعد كل مرور عمود دوران.
7. قم بتخزين المستضد المسمى وقم بتخزين المستضد المسمى عند -80 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. حدد أفضل التركيزات والنسب للمستضدين المسمى للفحص (فحص لوحة المدقق)

1. قم بإعداد عينتين من المصل ، واحدة موجبة عالية والأخرى سالبة ، بحجم إجمالي 200 ميكرولتر لكل منهما.
2. Aliquot 4 ميكرولتر من المصل وإضافة 1x PBS حتى الحجم النهائي 20 ميكرولتر لكل بئر للوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المكونة من 96 بئرا. استخدم نصف اللوحة للعينة الموجبة العالية والنصف الآخر للعينة السالبة ، كما هو موضح في الشكل 1 أ.
3. أضف 10 ميكرولتر من البيوتين و 10 ميكرولتر من المستضد المسمى بعلامة السلفو وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية للمستضدين المسميين بشكل مختلف ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. قم بتشغيل تخفيف تسلسلي أفقي لمستضد مسمى وتخفيف تسلسلي رأسي للمستضد الآخر المسمى.
4. تابع بقية خطوات الفحص الموضحة في 5.3 إلى 9.1.
5. احسب نسبة الإشارات من العينة الموجبة العالية مقابل كل إشارة من الإشارات المقابلة من العينة السالبة الموضحة في الشكل 1 ب.
6. حدد أفضل تركيزات المستضدات المسماة بالبيوتين والسلفو عن طريق تحديد نقطة ذات أعلى أو قريبة من أعلى نسبة من الإيجابية إلى السلبية. ضع في اعتبارك إشارة الخلفية المنخفضة من العينة السالبة لتحديد النسبة.
   ملاحظه: يتضمن يوم الفحص 1 الخطوة 4 إلى الخطوة 6.

فئة

4. قم بإعداد المخزن المؤقت للمستضد باستخدام التركيز الصحيح للمستضد المسمى بعلامة البيوتين / السلفو

1. حدد التركيز المنطقي لكل مستضد بناء على مقايسة لوحة المدقق.
2. قم بإعداد 3 مل من محلول المستضد لكل لوحة ، باستخدام التركيز المنطقي للمستضد المسمى البيوتين / السلفو للمخزن المؤقت للمستضد.

< p class = "jove_title" >5. احتضان عينات المصل مع مستضد مصنف

ملاحظة: هناك بروتوكولان في هذا القسم ، أحدهما بدون علاج حمض المصل والآخر مع علاج حمض المصل. تستخدم جميع فحوصات الأجسام المضادة الذاتية للجزائر باستثناء فحص الأجسام المضادة الذاتية للأنسولين (IAA) بروتوكولا منتظما بدون علاج حمض المصل من الخطوات 5.1 إلى 5.5 ، بينما يتخطى اختبار IAA هذه الخطوات ويستخدم بروتوكولا مع علاج حمض المصل من الخطوات 5.6 إلى 5.9.

1. Aliquot 4 ميكرولتر من المصل وإضافة 1x PBS حتى الحجم النهائي 20 ميكرولتر لكل بئر للوحة PCR 96 بئر.
2. أضف 20 ميكرولتر من محلول المستضد المسمى لكل بئر.
3. قم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب لتجنب الضوء.
4. ضع اللوحة على شاكر (سرعة منخفضة) عند RT لمدة 2 ساعة.
5. ضع الطبق في الثلاجة 4 درجات مئوية واحتضنه طوال الليل (18 - 24 ساعة).
   ملاحظه: تم تصميم البروتوكول التالي للخطوات من 5.6 إلى 5.9 فقط لمقايسة IAA وتخطي فحوصات الأجسام المضادة الذاتية الأخرى هذه الخطوات.
6. امزج 15 ميكرولتر من المصل مع 18 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 0.5 مولار لكل عينة مصل. احتضن هذا الخليط في RT لمدة 45 دقيقة.
7. قم بإعداد محلول المستضد بالتركيز المنطقي للبيوتين والمستضد المسمى بعلامة السلفو ، بناء على اختبار لوحة المدقق ، باستخدام عازلة المستضد. في كل بئر ، يتم وضع 35 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمستضد ، الذي يحتوي على البيوتين والمستضد المسمى Sulfo-tag ، في لوحة PCR جديدة.
8. قبل الانتهاء من خطوة الحضانة لمدة 45 دقيقة (الخطوة 5.6) ، أضف 8.3 ميكرولتر من 1 M Tris pH 9.0 إلى جانب كل بئر على لوحة المستضد (الخطوة 5.6). من المهم الحد من الاختلاط بين المخزن المؤقت Tris والمستضد. انقل على الفور 25 ميكرولتر من المصل ، المعالج بالحمض ، في الخطوة 5.6 ، إلى كل بئر وقم بتحريك المحلول. قم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب لتجنب الضوء.
9. ضع الطبق على شاكر (سرعة منخفضة) عند RT لمدة ساعتين ، ضع الطبق في الثلاجة 4 درجات مئوية واترك الطبق يحتضن طوال الليل (18 - 24 ساعة).

< p class = "jove_title" >6. تحضير لوحة الستربتافيدين

1. خذ طبق ستربتافيدين من الثلاجة 4 درجات مئوية واترك الطبق يصل إلى RT.
2. بمجرد أن تصبح لوحة الستربتافيدين في RT ، أضف 150 ميكرولتر من 3٪ Blocker A إلى كل بئر.
3. قم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب.
4. احتضن الطبق في الثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل.
   ملاحظة: يتضمن يوم الفحص 2 الخطوة 7 إلى الخطوة 9.

فئة

7. نقل المصل / المستضد يحتضن إلى صفيحة الستربتافيدين

1. في اليوم التالي ، أخرج طبق الستربتافيدين من الثلاجة وتخلص من المخزن المؤقت من اللوحة. ضع بعض المناشف الورقية الجافة على الطاولة واضغط على اللوحة رأسا على عقب حتى لا يكون هناك المزيد من المخزن المؤقت داخل الآبار.
2. املأ لوحة الستربتافيدين الفارغة ب 150 ميكرولتر من PBST لكل بئر وتخلص من PBST من اللوحة ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
3. انقل 30 ميكرولتر من المصل / المستضد المحتضن لكل بئر إلى صفيحة الستربتافيدين.
4. غطي الطبق بورق الألمنيوم لتجنب الضوء. رج الطبق ، على درجة حرارة منخفضة ، على RT لمدة 1 ساعة.

8. اغسل اللوحة وأضف المخزن المؤقت للقراءة

1. تخلص من الحاضنات من اللوحة. أضف 150 ميكرولتر من PBST لكل بئر وتخلص من PBST من اللوحة ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
2. بعد الغسيل ، أضف 150 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للقراءة.
   ملاحظه: من المهم منع فقاعات الهواء في المحلول لأن هذا سيؤثر على كيفية قراءة اللوحة على جهاز قارئ الألواح.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: منحنى ROC لتحديد الحد الأقصى لإيجابية الفحص.تم^{اختيار النسبة} المئوية 99 من الخصوصية المقابلة لحساسية 85٪ ويتم تمثيلها كقيمة مؤشر تبلغ 0.023. تم أخذ هذا الحد الأعلى للفحص من 100 عنصر تحكم صحي.

المواد