مقايسة مناعية ورقية للكشف عن الغلوبولين المناعي G

الملخص

المصدر: Peng ، Y. et al. ، الارتباط التساهمي للأجسام المضادة بأقراص ورق السليلوز وتطبيقاتها في المقايسات المناعية اللونية بالعين المجردة.J. Vis. Exp. (2016)

يوضح الفيديو مقايسة مناعية ورقية ، تتضمن أقراص السليلوز الوظيفية الأمين المتشابكة مع الجلوتارالديهايد. يؤدي التثبيت التساهمي للأجسام المضادة الخاصة ب IgG-FC ، متبوعا بإدخال الغلوبولين المناعي G والأجسام المضادة للكشف المترافق مع بيروكسيداز الفجل ، إلى تغيير اللون يؤكد وجود الغلوبولين المناعي G.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تطعيم المجموعات الوظيفية أمين على أقراص ورق السليلوز

1. قم بإعداد قطعة واحدة من الورق المربع بأبعاد 1 سم × 1 سم ، و 100 قرص ورقي مصنوع من ورق السليلوز رقم 1 بقطر 6.0 مم (ورق ترشيح متوسط التدفق) باستخدام ثقب ثقب.
2. لاشتقاق مجموعات -NH₂ على الأقراص الورقية ، اخلطي 1 مل 3-أمينوبروبيل تريميثوكسيسيلان (APS) و 10 مل من الأسيتون في زجاجة زجاجية سعة 50 مل في غطاء الدخان. أضف أقراص الورق إلى خليط الكاشف APS المحضر حديثا ، واحتضانه لمدة 5 ساعات مع التحريك المداري (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
   أنذر: التعامل مع APS والأسيتون في غطاء الدخان.
3. صب المحلول الزائد من الزجاجة سعة 50 مل في حاوية نفايات عضوية.
4. أضف 10 مل من الأسيتون إلى الزجاجة ، واخلطها جيدا واسكبها تماما لإزالة أي APS غير متفاعلة والشوائب الأخرى. كرر هذه الخطوة مرتين.
5. انشر الأقراص الورقية على المنشفة الورقية وضعها في فرن 110 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. اترك الأقراص الورقية لتبرد. قم بتخزين الأقراص في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل في درجة حرارة الغرفة.
6. استخدم التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) للتحقق من تطعيم مجموعات الأمين على ورق السليلوز المربع ، كما هو موضح أدناه (الشكل 1 أ).
   1. قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح أداة التحليل الطيفي FTIR.
   2. افتح برنامج التحليل الطيفي FTIR.
   3. انتقل إلى "القياس → التهيئة". ستتحول مستطيلات "BS: KBr" و "المصباح: الأشعة تحت الحمراء" و "الليزر" إلى اللون الأخضر عند الانتهاء من التهيئة.
   4. اختر "البيانات" أسفل المستطيلات ، وحدد "٪ Transmittance" و "Happ-Genzel" و "45" و "4.0" و "Min: 400 ، Max: 4000" ل "وضع القياس" و "Apodization" و "عدد عمليات المسح" و "الدقة" و "النطاق (cm-1)".
   5. انقر فوق "قياس".
   6. حدد "ملف البيانات" لبيانات الخلفية. اكتب التعليقات.
   7. انقر فوق "BKG" للحصول على خط الأساس للخلفية.
   8. قم بإصلاح الورق المربع على حامل عينة الفيلم.
   9. حدد "ملف البيانات" لنموذج البيانات. اكتب التعليقات.
   10. انقر فوق "عينة" للحصول على أطياف العينة.
   11. أغلق تطبيق التحليل الطيفي FTIR وقم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر.
7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه (الخطوات من 1.1 إلى 1.6) لإعداد ورق وأقراص سليلوز مربعة من الدرجة رقم 113 (ورق ترشيح سريع التدفق) ، والحصول على أطياف FTIR للورق المربع رقم 113 (الشكل 1 ب).

< p class = "jove_title" >2. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم الورقية (ELISA) للكشف عن الغلوبولين المناعي G (IgG)

1. أضف 5 مل من محلول الجلوتارالديهايد 0.05٪ (محضر في محلول 50 ملي مولار PBS ، درجة الحموضة 7.4) إلى زجاجة زجاجية سعة 20 مل. اغمر 15 قرصا من أقراص ورق الترشيح متوسطة التدفق تعمل بالأمين في هذا المحلول واحتفظ بها لمدة ساعة واحدة مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة.
   1. في الوقت نفسه، كرر الخطوة 2.1 لإعداد 15 قرصا آخر من ورق الترشيح سريع التدفق يعمل بالألدهيد.
      أنذر: التعامل مع الجلوتارالديهايد في غطاء الدخان.
2. لإزالة الجلوتارالديهايد غير المتفاعل من أقراص الورق، ضع 15 قرصا من ورق الترشيح متوسط التدفق في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل، و15 قرصا من ورق الترشيح سريع التدفق في أنبوب آخر لأجهزة الطرد المركزي سعة 15 مل. أضف 5 مل من ماء DI إلى كل أنبوب ورج الأنابيب لمدة 10 ثوان. قم بإزالة الماء عن طريق الشفط باستخدام ماصة. كرر مرتين لإزالة أي جلوتارالديهايد غير متفاعل.
3. جفف الأقراص الورقية في فرن 37 درجة مئوية.
4. أضف 5 ميكرولتر و 8 ميكرولتر من الأجسام المضادة لجزء الماوس IgG-Fc 0.025 مجم / مل إلى كل من أقراص ورق الترشيح متوسطة التدفق وسريعة التدفق ، على التوالي ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة.
5. أضف 10 ميكرولتر من 50 ملي مولار PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل قرص ورقي دون إزالة الأجسام المضادة واحتضنه لمدة 40 دقيقة لتفاعل ألدهيد الأمين.
6. اغسل الأقراص الورقية ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.
7. جفف الأقراص الورقية في فرن على حرارة 37 درجة مئوية.
8. قم بسد أقراص الورق بسعة 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. اغسل كل قرص ورقي ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.
10. تشغيل معايير IgG.
    1. قم بتحميل 10 ميكرولتر من تركيزات IgG المختلفة (على سبيل المثال ، 0 و 10 و 125 و 250 و 500 نانوغرام / مل في PBS) على كل قرص في ثلاث نسخ. احتضن لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
11. اغسل الأقراص الورقية ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.
12. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة لجزء الفأر المترافق HRP IgG-Fc (1: 10،000 ، 10 ملي مولار PBS ، درجة الحموضة 7.4) ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
13. اغسل الأقراص الورقية ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.
    ملاحظه: ليس من الضروري إزالة المخزن المؤقت للغسيل لأن النتائج لا تتأثر بوجود المخزن المؤقت.
14. قم بتحميل خليط 10 ميكرولتر من TMB وبيروكسيد الهيدروجين على كل قرص.
15. التقط صورا لجميع الأقراص الورقية بكاميرا رقمية أو هاتف ذكي بعد 5 دقائق من الحضانة.
    ملاحظه: في الشكل 2 أ ، يرمز الحرف "0" إلى الأقراص الورقية المعالجة بتثبيت الأجسام المضادة ، ومحلول الجسم المضاد HRP / TMB بدون مصل IgG.
16. تحليل شدة كل قرص ورقي في الصورة بواسطة الصورة J.
    1. قم بتحويل الصور الملتقطة في الخطوة 3.15 إلى تنسيق ".tif".
    2. افتح برنامج "Image J".
    3. انتقل إلى "فتح → الملف" ، واختر الصورة المراد تحليلها.
    4. اختر زر الشكل "بيضاوي".
    5. انتقل إلى "الصورة → النوع → 32 بت".
    6. انتقل إلى "تعديل → عكس".
    7. انتقل إلى "تحليل → القياس".
    8. انسخ البيانات وحللها في جدول بيانات.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1.أطياف الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) للورق المربع المربع ذو التدفق المتوسط غير المعالج والمعالج ب APS (A) وورق الترشيح المربع سريع التدفق (B). أ. كانت أطياف ورق الترشيح المربع متوسط التدفق غير المعالج مشابهة لتلك الموجودة في ورق الترشيح المربع متوسط التدفق المعالج APS. تنتمي الزيادة في الشدة عند نطاقات 902-1،170 سم ^{- 1} و 1،210-1...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ورق ترشيح السليلوز، Grade1 (ورق ترشيح متوسط التدفق) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية بي تي إي المحدودة سنغافورة 1001 110 ورق ترشيح السليلوز, Grade113 (ورق ترشيح سريع التدفق) سيجما ألدريتش ، سنغافورة 1113-320 3-أمينوبروبيل تريميثوكسيسيلان سيجما ألدريتش ، سنغافورة تي 1255 >96٪ الجلوتارالديهايد سيجما ألدريتش ، سنغافورة جي 6257 الدرجة الثانية ، 25٪ في H2O ألبوم مصل الأبقار سيجما ألدريتش ، سنغافورة أ 2153 حليب مجفف منزوع الدسم لويس فرانسوا معبأة من قبل نبات الكبر المطبخ, سنغافورة قاعدة تريس بروميجا H5135 دوريات الصوديوم ميرك 106597 Na2HPO4 ميرك 106585 كيه 2 ب 4 ميرك 104873 كلوريد الصوديوم كالبيوكيم 567441 هيدروكسيد الصوديوميوم ميرك 106462 حمض الهيدروكلوريك ميرك 100317 محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) غير متاح غير متاح يتم تحضير PBS ، الذي يحتوي على 137 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، و 2.7 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، و 8.0 مليمول / لتر من Na2HPO4 و 1.5 مليمول / لتر KH2PO4 ، بالماء ويتم تعديله على درجة الحموضة 7.4 مع 0.1 مول / لتر هيدروكسيد الصوديوم أو 0.1 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك أسيتون تي هاي تشيم بي تي إي المحدودة سنغافورة 9005-68 خليط من TMB ومحلول بيروكسيد الهيدروجين 1-خطوة الترا TMB-ELISA الحل ، بيرس الحراري العلمي 34029 1 لتر تقارب الماعز المنقى المضاد للفأر IgG-Fc طلاء الأجسام المضادة مختبرات البيثيل أ 90-131 أ مصل الفأر المرجعي مختبرات البيثيل RS10-101-5 9.5 مجم / مل HRP الماعز المترافق المضاد للكشف IgG-Fc مختبرات البيثيل أ 90-131 ف معدات فورييه تحويل مقياس الطيف الضوئي بالأشعة تحت الحمراء شيمادزو IR برستيج-21 غير متاح فرن نوف FN500 غير متاح خلاط توربو VM-2000 MYC المحدودة غير متاح الصورة J RGB ، تنزيل مجاني غير متاح