فحص في المختبر لتقييم تأثير الأجسام المضادة على المبيضات الاستوائية الحيوية

الملخص

المصدر: Chandley، P.، et al. اختبار اختزال قائم على التيترازوليوم قابل للذوبان لتقييم تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية المبيضات الاستوائية. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لدراسة تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية الفطرية. يفرز الفطر الممرض المبيضات الاستوائية عامل ضراوة يفرز بروتيناز الأسبارياز 2 (Sap2) ، مما يسهل تكوين الأغشية الحيوية. عند إدخال مصل معطل بالحرارة يحتوي على أجسام مضادة خاصة ب Sap2 تمنع نضوج الأغشية الحيوية ، يتم تقييم صلاحية الخلايا الفطرية باستخدام مقايسة كروموجينيك.

البروتوكول

ص الفئة = "jove_title" >1. ج. تكوين الأغشية الحيوية الاستوائية

1. قم بإعداد أغشية المبيضات الحيوية في صفيحة ميكروتيتر البوليسترين ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئرا كما هو موضح سابقا (الشكل 1).
2. أضف 100 ميكرولتر من مزرعة C. tropicalis (من 10⁶ خلايا / مل مخزون ، محضرة على النحو الوارد أعلاه) إلى صفيحة ميكروتيتر 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل 2 أ). احتفظ بالعمودين الأخيرين (11 و 12) كعناصر تحكم سلبية "لا يوجد فطر بالإضافة إلى المصل" و "لا فطر ولا مصل" عن طريق عدم إضافة الخلايا الفطرية. املأ العمودين 11 و 12 ب 100 ميكرولتر من وسط حمض مورفولين بروبان سلفونيك (MOPS) 1640 من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) وحده.
3. قم بتغطية لوحة الميكروتيتر بغطاء ورقائق الألومنيوم. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة.
4. في اليوم التالي، قم بشفط الوسط بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات (دون لمس الأغشية الحيوية أو تعطيلها). اضغط على اللوحة برفق في وضع مقلوب على أوراق النشاف لإزالة أي وسط متبقي.
5. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (لكل بئر) باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف PBS برفق شديد على طول الجدران الجانبية للبئر لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية. قم بشفط PBS بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات. كرر غسل PBS 2x (ما مجموعه ثلاث غسلات).
6. لإزالة PBS الزائد ، جفف اللوحة بالهواء (بدون غطاء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، داخل خزانة السلامة البيولوجية.

< p class = "jove_title" >2. علاج الأغشية الحيوية بالأجسام المضادة

ملاحظة: يمكن الآن معالجة الأغشية الحيوية لتقييم تثبيط نضوج الأغشية الحيوية بواسطة الأجسام المضادة. تم استخدام مصل الفئران كمصدر للأجسام المضادة متعددة النسيلة. مجموعات مختلفة من Sap2 المحصنة (Sap2-albicans و Sap2-tropicalis و Sap2-parapsilosis) جنبا إلى جنب مع الفئران المحصنة بالزيم نزفت بشكل رجعي وتم عزل المصل. تم تأكيد وجود الأجسام المضادة ل Sap2 باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم الخاصة ب Sap2 (ELISA).

1. قم بإجراء التعطيل الحراري للمصل (مصدر الأجسام المضادة متعددة النسيلة) عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام لاستبعاد دور المكمل في النشاط المثبط. قم بتعطيل السيروم بالحرارة قبل تخفيف المصل.
   ملاحظه: استخدم مصل الفئران المحصنة بالزيم ، والفئران السابقة للمناعة ، والمصل المستنفد من الأجسام المضادة الخاصة ب Sap2 كضوابط إضافية. تم تحضير المصل المستنفد للأجسام المضادة وفقا لدراسة سابقة. من بين التخفيفات التسلسلية (1:25 ، 1:50 ، 1:100 ، 1:200 ، 1:400 ، 1:800 ، 1: 1،600 ، 1: 3،200 ، 1: 6،400 ، و 1: 12،800) للمصل الذي تم اختباره في هذا البروتوكول ، لوحظ تثبيط نضوج الأغشية الحيوية عند 1:25 و 1:50 و 1:100 ؛ ومن ثم ، تم اختيار 1:50 لتحقيق التوازن بين التثبيط واستهلاك المصل.
2. تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات المصل المعطلة بالحرارة في وسط معقم RPMI 1640 MOPS (1:50). استخدم مخففا شائعا للمصل (1:50) لجميع عينات المصل المراد اختبارها لتثبيط نضوج الأغشية الحيوية.
3. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف المصل المحدد إلى كل بئر من صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا. لكل عينة ، أضف تخفيفات المصل في نسختين ، وفقا للتخطيط المرفق (الشكل 2 ب).
   1. في العمود 10 ، لا تضيف تخفيف المصل ؛ أضف فقط وسط RPMI 1640 MOPS للتحكم الإيجابي للفطريات ><فقط. ملاحظه: العمود 10 ، الصفوف G1-G8 و H1-H8 كان لها في البداية خلايا فطرية في RPMI-MOPS. ومع ذلك ، بينما تمت إضافة RPMI-MOPS إلى العمود 10 حتى بعد 24 ساعة ، كانت الصفوف G1-G8 بمثابة تحكم في PBS والصفوف H1-H8 كتحكم في عدم وجود مصل بعد 24 ساعة.
   2. في العمود 11 ، أضف مخففا بنسبة 1:50 من المصل إلى جميع الآبار ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي في المصل.
   3. في العمود 12 ، لا تضيف تخفيف المصل إلى أي بئر ؛ احتفظ بهذا على أنه لا يوجد فطريات في الدم سلبي.
4. غطي الطبق بغطاء ورقائق الألومنيوم. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

فئة

3. تقدير نشاط التمثيل الغذائي للأغشية الحيوية

1. في اليوم التالي، استنشق المصل بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات (دون لمس الأغشية الحيوية أو تعطيلها). اضغط على اللوحة برفق في وضع مقلوب على أوراق النشاف لإزالة أي مصل متبقي.
2. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من 1x PBS (لكل بئر) باستخدام ماصة متعددة القنوات ، مع إضافة PBS على طول الجدران الجانبية للبئر لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية. قم بشفط PBS بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات وكرر غسل PBS 2x (إجمالي ثلاث غسلات). جفف اللوحة بالهواء (بدون غطاء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، داخل خزانة السلامة البيولوجية لتجفيف أي PBS زائد.
3. تحضير XTT (2،3-مكرر- (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-سلفوفينيل) -2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) / ميناديون:
   1. تحضير XTT في Ringers Lactate المعقم كمحلول 0.5 جم / لتر. قم بإذابة 25 مجم من XTT في 50 مل من Ringers Lactate المعقم بالفلتر. Aliquot 10 مل في أنابيب منفصلة مغطاة بورق الألمنيوم وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
   2. تحضير الميناديون كمخزون 10 ملم. قم بإذابة 8.6 مجم من الميناديون في 5 مل من الأسيتون ووزع 50 ميكرولتر في 100 أنبوب دقيق منفصل. قم بتخزين الحصص عند -80 درجة مئوية.
   3. قم بإعداد محلول XTT / menadione قبل الاستخدام مباشرة عن طريق أخذ 10 مل من XTT وإضافة 1 ميكرولتر من الميناديون للحصول على محلول عمل 1 ميكرومتر.
4. أضف 100 ميكرولتر من محلول XTT / menadione لكل بئر من لوحة الميكروتيتر ذات 96 بئر. غطي الطبق بغطاء ورقائق الألومنيوم. احتضن اللوحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في الظلام.
5. انقل 80 ميكرولتر من المادة الطافية الملونة من كل بئر إلى طبق جديد مكون من 96 بئرا. اقرأ اللوحة عند 490 نانومتر.
6. احسب متوسط قيم امتصاص الآبار في العمود 10 (التحكم الإيجابي للفطريات فقط) ، والتي ستكون بمثابة قيمة مرجعية لحساب النسبة المئوية لتثبيط الأغشية الحيوية بواسطة كل عينة مصل باستخدام المعادلة (1).
   ٪ تثبيط الأغشية الحيوية = 100 - × 100 (1)

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تصوير المبيضات الاستوائية الأغشية الحيوية.(أ) تصور الأغشية الحيوية المبيضات الاستوائية التي تشكلت في قاع صفيحة ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا بعد إزالة وسط RPMI ، باستخدام مجهر مقلوب. تم التقاط الصورة باستخدام الفحص المجهري للحقل الساطع (لم يتم استخدام أي بقعة). (ب) تصور C. tropicalis الأغشية الحيوية التي تشكلت في قاع صفيحة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية بي دي فالكون 546021 1x برنامج تلفزيوني - محضر في المختبر كلوريد الصوديوم : 4 جم
KCl: 0.1 جم
Na₂HPO₄: 0.72 جم
KH₂PO₄: 0.12 g
ماء 500 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية بي دي فالكون 546041 96 بئر لوحات ميكروتيتر نونك 442404 حاضنه العامه مينادون سيغما م 5625 قارئ لوحة Microtiter العامه ماصة متعددة القنوات وأطراف العامه أطباق بتري تارسون 460090 رينجرز لاكتات - محضر في المختبر كلوريد الصوديوم 0.6 جرام لاكتات الصوديوم 0.312 جرام كلوريد البوتاسيوم 0.035 جرام كلوريد الكالسيوم 0.027 جرام ماء 100 مل. اضبط على درجة الحموضة 7.0 RPMI 1640 ماسح هايميديا AT180 XTT إنفيتروجين إكس 6493