Method Article

طريقة قائمة على التألق المناعي لتصور خلايا الخصل في عمليات التصائم بالتبريد

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Mizutani، Y. et al. ، استخدام الأجسام المضادة للفوسفو جيردين لتصور خلايا الخصل المعوية في استئصال الصائم العائم الحر.J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة قائمة على التألق المناعي لتصور خلايا الخصلة المعوية في التشريح الجليدي الصائم العائم الحر. داخل الزغابات المعوية ، يشير التوطين المشترك للتألق الأخضر عند الطرف اللمعي مع كتلة جذر حمراء ممتدة إلى وجود خلايا الخصل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

  1. تحضير 10 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 32.27 جم من فوسفات هيدروجين الصوديوم (Na2HPO4 · 12H2O) ، 4.5 جم من فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH2PO4 · 2 H2O) ، 80.0 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) مضاف إلى الماء عالي النقاء إلى حجم نهائي قدره 10 لتر.
  2. تحضير 200 مل من PBS-T: 200 مل من PBS من الخطوة 1.1 مع 100 ميكرولتر من بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل الأثير إلى تركيز نهائي قدره 0.05٪ (المجلد: المجلد). تخزين في RT.
  3. أثناء ارتداء القفازات وواقي العين ، قم بإعداد 50 مل من السكروز 15٪ في محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪: يضاف 7.5 جم من السكروز إلى محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪ (جدول المواد) إلى الحجم النهائي 50 مل. تخزينها في RT.
    أنذر: يمكن أن يكون الاستنشاق و / أو ملامسة الجلد / العين مع الفورمالديهايد في محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪ خطيرا. تعامل بحذر.
  4. قم بإعداد 1.5 مل من 200 وحدة / مل محلول مخزون الصبغة المترافقة بالفالويد الفلورسنت: الفلودين - الفلورسنت صبغة مترافقة (300 وحدة في قارورة واحدة ، مواد صلبة مجففة بالتجميد ، الإثارة ، وأطوال موجات الانبعاث: 581 نانومتر و 609 نانومتر ، على التوالي) معلقة في 1.5 مل من الميثانول. قم بتخزين المحلول في الظلام عند -20 درجة مئوية.
  5. تحضير 5 مجم / مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول ، محلول مخزون ثنائي هيدروكلوريد (DAPI): 10 مجم من DAPI في 2 مل من N ، N-dimethylformamide (DMF). قم بتخزين المحلول في الظلام عند -20 درجة مئوية.
  6. تحضير 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS: 0.5 جم من BSA ، 10 مل من PBS. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة الطرف المشطوف لإبرة مستقيمة قياس 18 باستخدام قراصة ، واضغط على الطرف المقطوع بقرصة في اتجاه طولي للسماح للسائل بالتدفق عبر تجويف الإبرة (الشكل 1A1).
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
< p class = "jove_title" >2. تشريح وعزل الصائم

  1. تثبيت التروية للفأر
    1. ارتد القفازات واعمل في منطقة جيدة التهوية.
    2. قم بإعداد دورق زجاجي سعة 100 مل ، ومحلول فورمالين محايد مخزن بنسبة 10٪ ، وأدوات جراحية (مقص ، ملقط) ، وصينية معدنية ، وخيوط مقطوعة من النايلون 6-0 ، وإبرة مستقيمة عيار 18 محضرة كما في 1.7 ، وإبرة مجنحة عيار 22 ، وحقنة سعة 20 مل.
    3. قم بتحميل 20 مل من محلول الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10٪ من الدورق الزجاجي في المحقنة سعة 20 مل وقم بتوصيل الإبرة المجنحة قياس 22 بالمخرج.
    4. قم بإعداد الجيلاتين السائل عن طريق إضافة 1 جم من مسحوق الجيلاتين إلى 20 مل من PBS (الجيلاتين النهائي 5٪) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. بعد النقع في RT لمدة 15 دقيقة ، احتضن عند 50 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة دون رج.
      5. دوامة
    5. لفترة وجيزة واحتضانها عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى لإذابة الجيلاتين تماما. اترك الأنبوب في RT حتى الاستخدام.
    6. القتل الرحيم لفأر بالغ عن طريق خلع عنق الرحم.
    7. ضع الماوس من الخطوة 2.1.6 على صينية معدنية وقم بعمل شق صغير على الجلد من خلال الغضروف المتماثل باستخدام الأدوات الجراحية.
    8. قم بتوسيع الشق بكلتا يديه لكشف المناطق الصدرية والبطنية.
    9. افتح الصفاق لكشف الحجاب الحاجز ، ثم افتح الحجاب الحاجز على كلا الجانبين.
    10. اقطع القفص الصدري على طول الخطوط الإبطية الأمامية على كلا الجانبين ، ثم قم بإزالة الجدار الصدري عن طريق القطع في اتجاه عرضي في موضع الغدة الصعترية لكشف القلب.
    11. قم بعمل شق صغير في أذن الأذين الأيمن لتصريف الدم وإدخال إبرة مجنحة عيار 22 في قمة البطين الأيسر. ادفع المكبس لنفخ الأنسجة بمحلول فورمالين محايد مخزن بنسبة 10٪.
    12. بعد تعريض الأعضاء في الحوض ، قم بقطع نهاية المستقيم عن فتحة الشرج ، وافصل الأمعاء عن الجسم عن طريق قطع المساريق.
    13. لعزل الصائم ، قم بقطع الأمعاء على بعد 4 سم من الجانب الشرجي من antrum المعدة. تخلص من النصف الشرجي من الأمعاء الدقيقة المتبقية.
    14. قص الصائم إلى نصفين لتسهيل عملية التنظيف. قم بتحميل 20 مل من محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪ في المحقنة سعة 20 مل ، وقم بتوصيل الإبرة المستقيمة عيار 18 المحضرة في الخطوة 1.7 بالمخرج.
    15. حقن محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪ من أحد طرفي الصائم المقطوع لطرد محتويات الأمعاء وإصلاح سطح تجويف الأمعاء (الشكل 1A2).
    16. اغسل تجويف الأمعاء عن طريق حقن PBS كما هو موضح في الخطوة 2.1.15.
    17. اغسل الجيلاتين السائل في تجويف الأمعاء كما هو موضح في الخطوة 2.1.15 لاستبدال PBS بالجيلاتين السائل.
    18. أغلق أحد طرفي الصائم المقطوع عن طريق ربط الخياطة باستخدام خياطة مقطوعة من النايلون 6-0 ، واملأ الصائم بالجيلاتين السائل ، وأغلق الطرف الآخر عن طريق ربط الخياطة (الشكل 1A3).
    19. أضف أربع عقدة خياطة لتناسب قسم الصائم على شكل نقانق إلى الجزء المكتئب من cryomold (الشكل 1A4). < / > ملاحظه: بالنسبة للقوالب المبردة ذات القسم المكتئب 20 مم × 25 مم × 5 مم ، يفضل قسم الصائم الشبيه بالنقانق ~ 20 مم.
    20. انقع المناديل في 50 مل من السكروز 15٪ في محلول فورمالين محايد مخزن 10٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظه: تضمن هذه الخطوات الحماية بالتبريد عن طريق السكروز وتثبيت البروتين بواسطة الفورمالين من الجيلاتين والأنسجة. لا يذوب الجيلاتين الفورمالين الجيلاتين عند RT ، بينما يذوب الجيلاتين الجيلاتين غير الثابت عند 4 درجات مئوية عند RT.
< p class = "jove_title" >3. التجميد المفاجئ لأنسجة الصائم المملوءة بالجيلاتين

  1. عن طريق قطع الصائم عند عقدة الخياطة ، يتم الحصول على ثلاث قطع صائم تشبه النقانق مع ربط كلا الطرفين (الشكل 1A4). قم بمحاذاة القطع الشبيهة بالنقانق في بريدي لإضافة مركب التضمين لتحضير عينات الأنسجة المجمدة.
    2. قم
  2. بتجميد المبرد في الأيزوبنتان المبرد بالنيتروجين السائل. قم بتخزين قوالب التبريد في -80 درجة مئوية
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
< p class = "jove_title" >4. التألق المناعي لخلايا الخصل باستخدام عمليات القطع بالتبريد العائمة بحرية

  1. التقطيع بالتبريد
    1. اضبط كل من درجة حرارة غرفة ناظم التبريد (CT) ودرجة حرارة الجسم (OT) على -22 درجة مئوية. ضع كتلة الأنسجة المجمدة في حجرة التبريد في غرفة التبريد لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    2. أضف 3 مل من PBS إلى طبق استزراع مقاس 35 مم.
    3. قم بإزالة كتلة الأنسجة المجمدة من cryomold وقطع الكتلة إلى نصفين بشفرة حلاقة لكشف الجزء العرضي من الصائم. قم بتركيب نصف الكتلة على ظرف (محول ناظم البرد) لتقسيم مستوى القطع بشفرة الحلاقة.
    4. قسم الصائم المملوء بالجيلاتين إلى أقسام بسمك 30 ميكرومتر. استخدم ملقطا مجمدا لنقل الأقسام برفق إلى طبق الثقافة مقاس 35 مم المحضر في الخطوة 4.1.2 (الشكل 2 ب ، على اليمين).
  2. تطبيق الأجسام المضادة الأولية
    1. اغسل الأقسام العائمة الحرة في طبق الاستزراع مقاس 35 مم 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 3 مل PBS-T مع اهتزاز خفيف على شاكر متبادل (حوالي 36 مرة / دقيقة).
    2. تحضير محلول استرجاع المستضد: 0.3 مل من مركز محلول استرجاع المستضد (جدول المواد) في 2.7 مل من الماء فائق النقاء. أضف 3 مل من محلول استرجاع المستضد إلى طبق الاستزراع مقاس 35 مم الذي يحتوي على أقسام عائمة بحرية.
    3. أغلق الغطاء ، وأغلق الفجوة بين الطبق والغطاء بشريط من شريط الفينيل ، واحتضن عند 50 درجة مئوية في حاضنة تهجين لمدة 3 ساعات دون اهتزاز.
    4. أخرجي الطبق من الحاضنة واتركيه يبرد في RT لمدة 20 دقيقة. بعد إزالة شريط الفينيل ، اغسل الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 3 مل من PBS-T ورج خفيف.
    5. قم بشفط PBS-T وأضف 5 قطرات من محلول الحجب (جدول المواد) إلى الأقسام. احتضن في RT لمدة 5 دقائق مع رج خفيف.
    6. تحضير محلول الأجسام المضادة الأساسي: 495 ميكرولتر من 5٪ BSA في PBS مع 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة phospho-Y1798 girdin (pY1798) (جدول المواد). أضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى الأقسام (لا يلزم إزالة محلول الحظر).
    7. ضع الطبق في حجرة حضانة رطبة واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج خفيف. < / > ملاحظه: يمكن تمديد الحضانة الليلية إلى ما يصل إلى ثلاث ليال.
  3. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية
    1. اغسل الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 3 مل من PBS-T مع رج خفيف.
    2. تحضير محلول مخزون DAPI المخفف: 2 ميكرولتر من محلول مخزون DAPI (الخطوة 1.5) ، 998 ميكرولتر من PBS.
    3. اصنع محلول الأجسام المضادة الثانوية: 476 ميكرولتر من 5٪ BSA في PBS ، 10.5 ميكرولتر من محلول DAPI المخفف ، 12.5 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة المترافقة بالفالويد الفلوري ، 1 ميكرولتر من الماعز المضاد للأرانب IgG-fluorescent صبغة مترافقة (الطول الموجي: الإثارة 496 نانومتر ، الانبعاث 520 نانومتر).
    4. بعد شفط PBS-T ، ضع محلول الجسم المضاد الثانوي واحتضنه في غرفة حضانة محمية من الضوء في RT لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز خفيف.
    5. اغسل الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 3 مل من PBS-T ورج خفيف.
    6. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة PBS-T واستبدله ب 3 مل من PBS يفتقر إلى بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل إيثر. انقل الطبق إلى مجهر مجسيم.
    7. ضع 200 ميكرولتر من PBS في قطرة في وسط شريحة زجاجية بيضاء مطلية ب MAS وانقل قسما واحدا من الصائم من الطبق إلى القطرة باستخدام طرف ماصة P200.
    8. بعد ضبط محاذاة المقطع تحت المجهر المجسم ، قم بشفط جميع PBS المتبقية المحيطة بالقسم.
    9. أضف 20 ميكرولتر من وسائط التركيب المائية وضع غطاء مقاس 20 × 20 مم فوق الوسائط.
    10. أغلق حواف الغطاء على الفور بوسائط تثبيت قائمة على الزيلين. ضع الشريحة على خريطة خشبية واترك وسائط التثبيت القائمة على الزيلين تتصلب عند RT لمدة 2-3 ساعات.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. بعد أن تصلب وسائط التثبيت القائمة على الزيلين ، يمكن تخزين الشرائح لمدة 2-3 أسابيع في صندوق شرائح محمي من الضوء في RT.
< p class = "jove_title" >5. الفحص المجهري متحد البؤر

  1. ضع زيت الغمر على هدف 63X من المجهر متحد البؤر. اقلب شريحة الغطاء لأسفل وضع الشريحة على المسرح.
  2. قم برقمنة صور TC التي تم الحصول عليها بأطوال موجات الليزر 405 و 488 و 555 نانومتر واحفظ الصور بتنسيق tiff (.tiff).
    ملاحظه: اختر مجموعة مرشح الكشف المناسبة للأصباغ الفلورية (أي الحد الأقصى للإثارة / الانبعاث: 358/461 نانومتر و 490/525 و 590/617).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: حشوة الجيلاتين لأقسام الصائم للحفاظ المورفولوجي للعمليات البردية
(أ) صور فوتوغرافية لإجراءات الملء داخل اللمعة للفأر الصائم بالجيلاتين. (أ 1) تمت إزالة الطرف المشطوف لإبرة مستقيمة عيار 18 لتجنب ثقب جدار الأمعاء. (A2) تم حقن محلول الفورمالين المحايد المخزن المؤقت (10٪) في أحد طرفي الصائم المقطوع لشطف محتويات الأمعاء وإصلاح سطح تجويف الأ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments Slc: إناث الفئران DDY البالغة من العمر 6 أسابيع تشوبو كاغاكو شيزاي لا ينطبق هيدروجين فوسفات ثنائي الصوديوم 12 ماء (Na2HPO412H2O) واكو 196-02835 ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم (NaH2PO42H2O واكو 199-02825 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) واكو 199-10665 تريتون X-100 ، بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل الأثير كاتاياما للكيماويات لا ينطبق سكروز واكو 190-00013 محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪ موتو كيميكال 20215 الخطوة 1.3. الفالودين الفلورسنت صبغة مترافنة, أليكسا فلور 594 الفالودين ثيرموفيشر العلمي أ 12381 ميثانول ناكالاي تسك 21915-35 DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole، ثنائي هيدروكلوريد) ثيرموفيشر العلمي د1306 N.N-ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) ناكالاي تسك 13015-75 ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 9647-10 جي إبرة مستقيمة من الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 18 تيرومو NN-1838R U.S.P. 6-0 ، خياطة مقطوعة من النايلون 60 سم ، Crownjun كونو سيساكوشو لا ينطبق إبرة مجنحة قياس 22 تيرومو إس في-22DLK 20 مل حقنة TERUMO تيرومو إس إس-20 إي إس أنبوب الطرد المركزي 50 مل برنامج النقاط التجارية 91050 15 مل أنابيب الطرد المركزي Iwaki إيواكي هاتف: 2325-015 1.5 مل أنبوب اختبار صغير نجم RSV-MTT1.5 مسحوق الجيلاتين ، جيلاري بلانك نيتا بيولوجي 2809 مركب التضمين لعينة الأنسجة المجمدة ، O.C.T. مركب 118 مل 12 قطعة ساكورا فاين تك 4583 Cryomold ، طبق CRYO رقم 3 ، 125 قطعة ، حجم البئر 20 × 25 × 5 (مم) شوي ووركز 1101-3 إيزوبنتان ناكالاي تسك هاتف: 26404-75 صحن زراعة خلايا الصقر 35 × 10 مم سهل الإمساك كورنينج 353001 مركز محلول استرجاع المستضد ، محلول الاسترجاع المستهدف الرقم الهيدروجيني 9 10x داكو إس 2367 تركيز محلول استرجاع المستضد في الخطوة 4.2.2. كتلة البروتين داكو إكس 0909 حل الحجب في 4.2.5. الأجسام المضادة Phospho-Y1798 girdin (pY1798) المختبرات المناعية البيولوجية (IBL) = الشركة X هاتف: 28143 الأجسام المضادة Phospho-Y1798 girdin في الخطوة 4.2.6. الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 ثيرموفيشر العلمي أ 11034 وسائط التركيب المائية ، إطالة الذهب المضاد للتلاشي ثيرموفيشر العلمي ص36930 أغطية ، ماتسونامي مايكرو غطاء زجاجي 22 × 22 مم 100 قطعة سمك رقم 1 ماتسونامي جلاس C022221 Entellan وسائط تركيب جديدة قائمة على الزيلين للفحص المجهري ميرك ميليبور 107961 زجاج منزلق مطلي ب MAS أبيض ماتسونامي جلاس MI-MAS-01 خشبي Mappe KO- نوع شوي ووركز 99-40007 زيت الغمر 518 فهرنهايت خالي من الفلورة 20 مل زييس هاتف: 444960 الماصات ، Pipetman P (P2 ، P20 ، P200 ، P1000) جيلسون F144801 ، F123600 ، F123601 ، F123602 نظام إنتاج المياه عالي النقاء أدفانتك جي إ-590 قفاز بلاستيكي ، قفاز النتريل النجمي نجم RSU-NGVM كرايوستات لايكا مايكروسيستمز سم 1950 ديب فريزر ، SANYO Ultra Low سانيو إم دي إف -382 ثلاجة عرض نيهون فريزر NC-ME50EC حمام مائي ، Thermominder SDminiN (لإذابة الجيلاتين عند 50 درجة مئوية) تايتك 0068750-000 حاضنة التهجين (لاسترجاع المستضد عند 50 درجة مئوية) تايتك إتش بي -100 غرفة حضانة للتلطيخ المناعي كوزمو بيو 10 فعل شاكر متبادل للكيمياء المناعية (لدرجة حرارة الغرفة) تايتك رقم 1 شاكر متبادل للكيمياء المناعية (ل 4 درجة مئوية) طوكيو ريكا كيكاي MMS-3010 مجهر مجهر (لمناولة الأنسجة) أوليمبوس ش.ز61 المجهر المجري (للشكل 1 ب) لايكا مايكروسيستمز M165FC المجهر الفلوري (للشكل 3) نيكون E800 مجهر المسح بالليزر متحد البؤر زييس إل إس إم 700

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tuft CellsImmunofluorescence MethodJejunum CryosectionsConfocal MicroscopyAntigen RetrievalPhalloidin StainingDNA Binding DyePrimary AntibodiesSecondary AntibodiesMounting Media

Related Articles