تقنية In Vivo لتتبع تهريب الخلايا التائية ثنائية النوعية التي يسببها الأجسام المضادة إلى الأورام

الملخص

المصدر: Espinosa-Cotton ، M. ، et al. تتبع الاتجار بالخلايا التائية ثنائية النوعية التي يسببها الأجسام المضادة باستخدام الخلايا التائية البشرية المنقولة باللوسيفيراز. J. Vis. Exp. (2023).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتتبع تهريب الخلايا التائية التي يسببها الأجسام المضادة ثنائية النوعية إلى الأورام في نموذج الفأر. يتم حقن الخلايا التائية المستجيبة المنقولة لوسيفيراز في فأر مع طعم خلية سرطانية تحت الجلد. ثم يتم إدخال الأجسام المضادة ثنائية النوعية ، وترتبط بالخلايا التائية والخلايا السرطانية. يتم تتبع توطين الخلايا التائية باستخدام التصوير الحيوي ، حيث يشير حجم الإشارة إلى مدى تسلل الخلايا التائية إلى الورم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تعداء خلايا 293T مع لوسيفيراز وحصاد الطاف الفيروسي

1. ثقافة خلايا 293T
   1. قم بإعداد الوسائط عن طريق إضافة ما يلي إلى لتر من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco لكل منهما: 110 مل من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (FBS) ، 11 مل من البنسلين والستربتومايسين.
   2. قم بإذابة خلايا 5 × 10⁶ 293T ونقلها إلى قارورة T175 باستخدام الوسائط المعدة كما هو موضح أعلاه.
   3. قم بتقسيم خلايا 293T 1:10 كل 3 أيام لمدة 6 أيام. لا تسمح للخلايا بأن تصبح أكثر من 90٪ ملتقية.
2. تعداء خلايا 293T
   ملاحظه: يتم حساب الكميات التالية من الكواشف لنقل قارورة T175 واحدة من خلايا 293T. اضبط وفقا لذلك إذا كان سيتم تحويل المزيد من القوارير.
   1. انقل 1.5 مل من الوسائط إلى كل من الأنبوبين سعة 50 مل باستخدام ماصة. إلى أنبوب واحد ، أضف 10 ميكروغرام من بلازميد VSV-G ، و 20 ميكروغرام من Gag / pol ، و 20 ميكروغرام من بلازميد لوسيفيراز طماطم TD الحمراء (CBR-TDR) وتخلط. إلى الأنبوب الآخر ، أضف 100 ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف التعداء في المختبر واخلطه. احتضان كلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق
      ملاحظه: تم توفير جميع البلازميدات الموصوفة في هذه المخطوطة من قبل الدكتور فلاديمير بونوماريف.
   2. انقل الوسائط التي تحتوي على كاشف تعدين الحمض النووي في المختبر بالتنقيط إلى الأنبوب الذي يحتوي على بلازميدات الحمض النووي (أكثر من 30 ثانية تقريبا) واخلطها برفق باستخدام ماصة. احتضن في RT لمدة 20 دقيقة.
   3. خلال هذه الحضانة التي تبلغ مدتها 20 دقيقة ، افصل خلايا 293T عن طريق إضافة 5-10 مل من 0.05٪ من التربسين. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف 10 مل من الوسائط وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 1.5 مل من الوسائط.
   4. أضف الوسائط التي تحتوي على كاشف تعداء الحمض النووي في المختبر وبلازميدات الحمض النووي إلى خلايا 293T واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   5. انقله إلى قارورة T175 وأضف 18 مل من الوسائط. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
   6. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسائط بعناية باستخدام ماصة زجاجية دون فصل الخلايا. استبدل ب 18 مل من الوسائط الطازجة. احتضان عند 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة.
3. حصاد المواد الطافية الفيروسية
   1. قم بإزالة المادة الطافية الفيروسية باستخدام ماصة موضوعة على الثلج. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا والحطام.
      ملاحظه: إذا كانت حبيبات الخلية كبيرة ، فمن المحتمل أن تكون الخلايا قد تعطلت من القارورة عند إزالة المادة الطافية. يمكن طلاء هذه الخلايا مرة أخرى في قارورة جديدة بوسائط جديدة.
   2. قم بتصفية المادة الطافية الفيروسية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
   3. استخدم المادة الطافية الفيروسية على الفور. احتفظ بها على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة ، أو قم بتجميدها عند -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

< p class = "jove_title" >2. توسيع ونقل الخلايا التائية البشرية المنشطة مع لوسيفيراز

1. تنشيط الخلايا التائية البشرية في المختبر
   1. اغسل الخرزات بإضافة 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 2 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) إلى أنبوب معقم سعة 15 مل ، وإضافة حبات (حبة واحدة لكل خليتين تائية) ، ووضعها في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين ، وشفط PBS.
   2. قم بإعداد الوسائط كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 ، ثم أضف IL-2 إلى التركيز النهائي البالغ 30 وحدة دولية / مل وأضف الخرز المغسول. اصنع 2.5 مل من الوسائط لكل مليوني خلية تائية يتم تنشيطها.
   3. عد الخلايا التائية (المنقاة حديثا أو المنقاة مسبقا ، المجمدة ، المذابة ، وغسلها) باستخدام مقياس الدم وصبغة المثقب الزرقاء. أضف الخلايا التائية إلى الوسائط المعدة في الخطوة 2.1.2 واقلب الأنبوب برفق للخلط. ستتوسع الخلايا التائية 20 ضعفا على الأقل اعتمادا على مصدر الخلايا وصحتها العامة. حدد عدد الخلايا التائية المراد تنشيطها عن طريق حساب العدد المطلوب لعلاج الفئران والقسمة على 20. هنا ، تم استخدام 20 × 10⁶ خلايا T لكل فأر بناء على التجارب الأولية.
   4. صفيحة 2.5 مل من الوسائط التي تحتوي على مليوني خلية تائية وخرز و (إنترلوكين 2) IL-2 في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. استزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة₅٪ ثاني أكسيد الكربون.
   5. افحص الخلايا التائية تحت مجهر 20x كل يوم لمدة 3 أيام القادمة لتحديد وقت التحويل باستخدام لوسيفيراز. تكون الخلايا جاهزة عندما تتكتل معا وتستنفد الوسائط ، وتحولها من الأحمر / الوردي إلى البرتقالي الفاتح.
2. تحضير ألواح ريترونكتين
   ملاحظه: يستخدم ريترونكتين لتغطية الألواح المستخدمة في التنبيغ لأنه يعزز نقل الجينات.
   1. أضف 2 مل من 20 ميكروغرام / مل ريترونكتين في PBS إلى بئر من صفيحة 6 آبار غير معالجة. احتضان لمدة ساعتين في RT أو 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. مطلوب بئر واحد مطلي بالرجعية لكل مليوني خلية تائية ليتم نقلها.
   2. استنشق الريترونكتين دون خدش الجزء السفلي من اللوحة.
   3. أضف 3 مل من 2٪ BSA في PBS (مفلتر معقم) لكل بئر في اللوحة المكونة من 6 آبار. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT.
3. التنقيب
   1. استنشق BSA دون خدش الجزء السفلي من اللوحة.
   2. اغسل الآبار مرة واحدة ب 3 مل من PBS لكل بئر. استمر أو استبدلها ب PBS طازج واترك الطبق مغطى عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   3. أضف 2 مل من المادة الطافية الفيروسية CBR-TDR luciferase (التي تم جمعها في الخطوة 1.3) لكل بئر.
   4. جهاز طرد مركزي عند 1،240 × جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية.
4. التنبيغ
   1. عد الخلايا التائية.
   2. استنشق المادة الطافية الفيروسية دون خدش الجزء السفلي من اللوحة.
   3. لوحة مليوني خلية تائية لكل بئر في 6 مل من DMEM تحتوي على 30 وحدة دولية / مل من IL-2 البشري.
   4. افحص الخلايا التائية يوميا. تكون الخلايا التائية جاهزة للتوسع عندما تكون شبه ملتقية ، عادة بعد يومين.
   5. عندما تكاد الخلايا التقاء ، اغسلها برفق من قاع اللوحة باستخدام ماصة وانقل كل بئر إلى قارورة T75 منفصلة. أضف 9 مل من الوسائط ليصبح المجموع 15 مل من الوسائط لكل قارورة.
   6. في اليوم التالي ، أضف 15 مل إضافية من الوسائط. يجب أن تكون الخلايا جاهزة للحقن في الفئران في اليوم التالي لإضافة الوسائط. تأكد من نجاح التنبيغ عن طريق إجراء قياس التدفق الخلوي (يحتوي بناء لوسيفيراز على فلوروفور طماطم TD المرئي في قناة PE).

فئة

3. نقش الخلايا التائية المنقولة باللوسيفيراز في الفئران المصابة بنقص المناعة

1. تحضير وعد الخلايا التائية للحقن.
   1. قم بإزالة الخلايا التائية من القوارير والعد. تكون الخلايا جاهزة للحقن عندما تتوسع 20x-30x ، عادة بحلول اليوم السابع بعد التنشيط.
   2. قم بالطرد المركزي للخلايا التائية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. بالنسبة للتجارب التي يتم فيها حقن الخلايا التائية بشكل منفصل عن الأجسام المضادة ثنائية النوعية ، قم بحساب الخلايا التائية وإعادة تعليقها بحيث يكون التركيز النهائي 20 مليون خلية تائية لكل 100 ميكرولتر من الوسائط. انتقل إلى الخطوة 3.2. بالنسبة للتجارب التي تستخدم الخلايا التائية المسلحة خارج الجسم الحي (EATs) ، انتقل إلى الخطوة 3.1.4.
   4. بالنسبة للتجارب التي تستخدم الخلايا التائية المسلحة خارج الجسم الحي ، قم بحساب الخلايا التائية وفصلها إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مل لكل مجموعة ، مع 20 مليون خلية لكل فأر. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك ثلاث مجموعات من خمسة فئران لكل منها ، فقم بإعداد ثلاثة أنابيب سعة 1.5 مل مع 100 مليون خلية تائية لكل منها.
   5. الطرد المركزي الأنابيب 1.5 مل عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الوسائط بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية التائية. قم بتعليق ما لا يزيد عن 50 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على الأجسام المضادة ثنائية النوع. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة
      ملاحظه: لأغراض التجارب التي أجريت في هذه الدراسة ، تم استخدام الأجسام المضادة ثنائية النوع التي تشارك الخلايا التائية IgG-[L] -scFv المملوكة للخلايا التائية التي تم إنشاؤها في المختبر. لتسليح الخلايا التائية ، استخدم 5 ميكروغرام من الجسم المضاد لكل 20 × 10 6 خلايا T. يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة ثنائية النوع المتاحة تجاريا.
   6. اغسل الأجسام المضادة الزائدة عن طريق إضافة 1,450 ميكرولتر من الوسائط إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بشفط الوسائط بعناية ، وإعادة تعليقها بتركيز 20 مليون خلية تائية مسلحة لكل 100 ميكرولتر من الوسائط.
2. الحقن والنقش في الفئران
   1. تخدير الفئران في غرفة توفر 3.5٪ (حجم / حجم) من الأيزوفلوران المستنشق في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين. يتم تخدير الفئران تماما عندما يختفي منعكس انسحاب دواسة الطرف الخلفي.
      ملاحظة: توفير الدعم الحراري طوال العملية.
   2. باستخدام إبرة 26 G ، قم بحقن 20 مليون خلية T في 100 ميكرولتر من الوسائط بأثر رجعي لكل فأر.
   3. قم بإدارة 1,000 U IL-2 المؤتلف تحت الجلد لدعم بقاء الخلايا التائية في الجسم الحي.
   4. يجب تطبيق الأجسام المضادة ثنائية النوعية خلف الحجاج (في العين غير المستخدمة لحقن الخلايا التائية) أو داخل الصفاق. اسمح للفئران بالتعافي من التخدير والعودة إلى أقفاصها.
      ملاحظة: مرة أخرى ، هنا ، تم استخدام الأجسام المضادة الخاصة التي تم إنشاؤها في المختبر ، ولكن يمكن استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا بدلا من ذلك. في التجارب هنا ، تم إعطاء 0.3-10 ميكروغرام من الجسم المضاد لكل فأر لكل جرعة. تم إعطاء الأجسام المضادة مرتين في الأسبوع لمدة 3-4 أسابيع.

فئة

4. التصوير في الجسم الحي للفئران المطعمة بالخلايا التائية المنقولة باللوسيفيراز

ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في يوم التصوير ، وهو ليس بالضرورة نفس اليوم الذي يتم فيه إعطاء الخلايا التائية و / أو الأجسام المضادة للفئران. عادة ، نقوم بإجراء التصوير بعد 24 ساعة من إعطاء الخلايا التائية المنقولة باللوسيفيراز.

1. تحضير D-luciferin
   1. قم بإذابة 1 جم من D-luciferin في 33.3 مل من PBS المعقم (التركيز النهائي: 30 ملغم/مل).
   2. قم بتقسيم D-luciferin المذاب إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة 33 × 1.5 مل واحتفظ بالأنابيب عند -20 درجة مئوية.
   3. في يوم التصوير ، قم بإذابة ما يكفي من حصصات 30 مجم / مل D-luciferin لعدد المراد تصويرها. أنبوب واحد يكفي ل 10.
      ملاحظة: أعد تجميد D-luciferin المتبقي بعد الاستخدام. D-luciferin مستقر لمدة خمس دورات تجميد / ذوبان على الأقل.
2. إعطاء D-luciferin للفئران
   ملاحظه: قبل إعطاء D-luciferin للفئران ، افتح برنامج التصوير وقم بتهيئة النظام. قد تستغرق الكاميرا عدة دقائق لتبرد ، ويجب أن يتم ذلك قبل حقن الفئران ب D-luciferin لضمان إمكانية التصوير بعد 5 دقائق من إعطاء الركيزة.
   1. تخدير ما يصل إلى خمسة فئران في غرفة توفر 3.5٪ (حجم / حجم) من الأيزوفلوران المستنشق في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين. يتم تخدير الفئران تماما عندما يختفي منعكس انسحاب دواسة الطرف الخلفي.
   2. بمجرد تخدير الفئران بالكامل ، قم بإعطاء 100 ميكرولتر من 30 مجم / مل D-luciferin لكل فأر (3 مجم لكل فأر) عن طريق الحقن خلف الحجاج بإبرة 26 جرام. قم بتصوير هذه المجموعة من الفئران قبل إعطاء D-luciferin للمجموعة التالية. ضع المجموعة التالية من الفئران في غرفة الأيزوفلوران المراد تخديرها أثناء تصوير المجموعة السابقة.
3. تصوير الخلايا التائية المنقولة باللوسيفيراز
   1. انقل الفئران المخدرة إلى الغرفة الضيقة للضوء في جهاز التصوير واستمر في إعطاء 3٪ من الأيزوفلوران بمعدل 0.5 لتر / دقيقة. ضع الفئران على جانبيها بحيث يكون الجناح الذي يحمل الطعم الغريب متجها لأعلى نحو الكاميرا. التقط مجموعة أخرى من الصور مع الفئران في وضع ضعيف لتقييم وجود الخلايا التائية في الرئتين.
   2. باستخدام لوحة تحكم الاكتساب، حدد Luminescent وPhoto وOverlay. اضبط وقت التعريض الضوئي على تلقائي، والتجميع على متوسط، وF/Stop على 1. الحصول على الصور. بعد الصورة الأولى، اضبط وقت التعريض الضوئي لمطابقة الوقت الذي تم حسابه تلقائيا للصورة الأولى بحيث يمكن مقارنة الصور اللاحقة مباشرة. قد يكون من المفيد التقاط صور ذات أوقات تعريض متعددة لتحديد وقت التعريض الضوئي الأمثل لتحقيق الإشارة الأكثر سطوعا دون تشبع البكسل.
   3. قم بإزالة الفئران من الأيزوفلوران ، والعودة إلى أقفاصها ، وراقبها حتى تصبح مستيقظة ومتنقلة.
   4. كرر الخطوات من الخطوة 4.2.1 حتى يتم تصوير جميع المجموعات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 293 خلايا T ATCC رقم التعريف الهاتفي-11268 جيش صرب البوسنه سيجما ألدريتش إيه 7030-10 جي حبات CD3 / CD28 جيبكو (ثيرموفيشر) 11161 د د-لوسيفيرين ، ملح البوتاسيوم جولدبيو الحظ -1 جي DMEM جيبكو (ثيرموفيشر) 11965092 كاشف تعداء الحمض النووي في المختبر (polyjet) مختبرات SignaGen SL100688 EDTA سيجما ألدريتش E9884-100G FBS جيبكو (ثيرموفيشر) 10437028 هفوة / بول بلازميد أدجين 14887 بلازميد GFP أدجين 11150-DNA.cg البنيسيلين ستربتومايسين جيبكو (ثيرموفيشر) 15140122 IL-2 البشري المؤتلف أنظمة البحث والتطوير 202-IL-010 / CF ريترونكتين تاكارا تي 100 ب التربسين جيبكو (ثيرموفيشر) 25-300-120 بلازميد VSV-G أدجين 8454 [م]