مقالة منهجية

تقنية التألق المناعي مزدوجة العلامات لتصور بروتينات المضيف ومسببات الأمراض في الخلية المصابة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Gachet-Castro ، C. et al. ، التألق المناعي مزدوج الملصقات باستخدام الأجسام المضادة من نفس النوع لدراسة تفاعلات المضيف والمسببات الممرضة.J. Vis. Exp.(2021)

يعرض هذا الفيديو تلطيخا مناعيا مزدوجا مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية المختلفة التي تربى في نفس النوع ، ويرتبطان على وجه التحديد بالبروتينات الطفيلية والمضيفة. علاوة على ذلك ، تسمح الأجسام المضادة الثانوية المصنفة التي تستهدف هذه الأجسام المضادة الأولية بالتصور المميز للبروتينات المضيفة والطفيلية ، مما يسهل دراسة تفاعل المضيف العامل الممرض.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. مزارع الخلايا والطفيليات

  1. قم بزراعة خلايا LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (CCL-7) في قارورة ثقافة خلية مقاس 25 سم تحتوي على وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مكمل بنسبة 10٪ FBS معطل بالحرارة (مصل الأبقار الجنينية) والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
  2. إصابة خلايا LLC-MK2 ب Trypanosoma cruzi (سلالة Y) وفقا لبروتوكول سابق.
  3. اجمع المادة الطافية للخلايا المصابة LLC-MK2 (5 مل) في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل لزراعة الخلايا سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق و 22 درجة مئوية لخفض بقايا الخلية. احتفظ بالأنبوب لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية للسماح للمثقبيات بالسباحة إلى المادة الطافية.
  4. اجمع المادة الطافية في أنبوب مخروطي جديد وجهاز طرد مركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 22 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على الطفيليات في وسط RPMI كامل لتحديد كثافة الخلية عن طريق عد الخلايا في غرفة Neubauer.
< p class = "jove_title" >2. التحكم في بروتوكول التألق المناعي

< p class = "jove_content" >ملاحظة: بمجرد الإصلاح ، من الممكن تخزين الألواح التي تحتوي على أغطية عند 4 درجات مئوية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة الحموضة 7.2) لمدة أسبوع واحد. ليتم تخزينها ، من المهم ألا تمر الخلايا بخطوة النفاذية.

  1. قم بتسوية خلايا LLC-MK2 (2 × 104) في 24 لوحة بئر تحتوي على أغطية مستديرة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية (UV) في وسائط RPMI لمدة 16 ساعة.
  2. بالنسبة للخلايا المصابة ، أضف مادة طافية تحتوي على T. cruzi (البند 1.4) إلى كل بئر بالتناسب (تعدد العدوى ، وزارة الداخلية 10: 1) واتركها لمدة 6 ساعات من العدوى. اغسل أغطية تحتوي على خلايا مصابة وغير مصابة خمس مرات بمحلول PBS ومثبتة بنسبة 2٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS (درجة الحموضة 7.2).
  4. قم باختراق الغطاء باستخدام 0.2٪ IGEPAL CA-630 (octylphenoxypolyethoxyethanol) في 1x PBS (PH 7.2) لمدة 10 دقائق في RT.
  5. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS.
  6. احتضان أغطية لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام محلول الحجب (2٪ ألبومين مصل بقري ، BSA في 1x PBS ، درجة الحموضة 7.2).
  7. احتضان أغطية الفأر لمدة 30 دقيقة في RT إما باستخدام الفأر أحادي النسيلة مضاد ل hnRNPA1 (مضاد للبروتين النووي الريبي غير المتجانس - A1) (التخفيف 1: 200) أو باستخدام الفأر متعدد النسيلة المضاد ل TcFAZ (بروتين منطقة التعلق بالسوط المضاد للمثقبيات) (التخفيف 1: 100) المخفف في محلول الحظر.
  8. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS.
  9. احتضان الغطاء لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام الماعز المضاد للفأر IgG F (ab') 2 (H + L) المقترن ب Alexa Fluor 488 (1: 600) جنبا إلى جنب مع الفالودين المترافق مع Alexa 594 (1: 300) لتلطيخ خيوط الأكتين (F-actin) في الخلية المضيفة المخففة في محلول الحظر.
  10. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. ضع كمية صغيرة من كاشف التثبيت المضاد للبهتان ProLong Gold مع وسط 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) على سطح الشريحة.
  12. باستخدام الملقط ، قم بإمالة الغطاء برفق في وسط التثبيت لمنع تكون الفقاعات. بمجرد أن يجف ، أغلق الغطاء إذا رغبت في ذلك.
< p class = "jove_title" >3. بروتوكول التألق المناعي مزدوج الملصقات باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة ومتعددة النسيلة التي يتم رفعها في نفس المضيف

  1. كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.6 الموضحة أعلاه.
  2. احتضان أغطية تحتوي على خلايا مصابة وغير مصابة بجسم مضاد متعدد النسيلة مضاد ل TcFAZ في الفأر (1: 100) مخفف في محلول مانع لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS.
  4. احتضن أغطية لمدة 30 دقيقة في RT باستخدام IgG F (ab') 2 (H + L) المضاد للفأر المقترن ب Alexa Fluor 647 (1: 600) المخفف في محلول الحظر.
  5. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS.
  6. قم بتنفيذ خطوة الحظر الثانية باستخدام AffiniPure rabbit anti-mouse IgG (H + L) المخفف (0.12 مجم / مل) في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة في RT.
  7. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم احتضن بالجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد ل hnRNP A1 IgG2b (1: 200) لمدة 30 دقيقة في RT.
  8. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS.
  9. احتضان الغطاء لمدة 30 دقيقة باستخدام الجسم المضاد IgG2b المضاد للفأر من الماعز المقترن ب Alexa Fluor 488 (1: 600) ومع الفالودين المقترن ب Alexa 594 (1: 300) المخفف في محلول الحظر.
  10. اغسل الغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1x PBS.
  11. كرر الخطوات من 2.8 إلى 2.10 الموضحة أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أليكسا فلور 488 - الجسم المضاد IgG2b تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية أ21141 الماعز المضادة للفأر AffiniPure Rabbit مضاد للفأر IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية ، الولايات المتحدة الأمريكية 315-005-003 الأجسام المضادة للفأر Alexa Fluor 488 - الجسم المضاد IgG F (ab') 2 (H + L) تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 11017 الماعز المضادة للفأر الجسم المضاد Alexa Fluor 594 IgG1 تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 21125 الماعز المضادة للفأر Alexa Fluor 647 - الجسم المضاد IgG F (ab') 2 (H + L) تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية أ21237 الماعز المضادة للفأر الأجسام المضادة ل hnRNPA1 IgG2b سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية التوصية 4528 الجسم المضاد للفأر الجسم المضاد المضاد ل TcFAZ (بروتين T. cruzi FAZ) مختبرنا داخلي الجسم المضاد للفأر ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 2153-10 جي بروتين الألبومين منظف Igepal CA-630 سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية ط 3021 منظف غير أيوني مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو ، ثيرمو فيشر علمي ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 12657-029 مصل البنسلين ستربتومايسين جيبكو ، ثيرمو فيشر علمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 15140-122 مضاد حيوي فالودين أليكسا فلور 594 تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 12381 علامة الأكتين إطالة الذهب المضاد للبهتان مع DAPI تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية ص36935 تركيب كاشف الوسائط RPMI 1640 1X مع L-glutamine كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية 10-040-السيرة الذاتية وسائط زراعة الخلايا حل Trypsin-EDTA سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية T4049-100 مل الكاشف الحيوي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Double Labeling ImmunofluorescenceHost Pathogen InteractionParasite Protein LabelingHost Protein LabelingMouse Primary AntibodiesSecondary Antibody OverlayConfocal Microscopy AnalysisActin Filament StainingDNA Stain MediumBlocking Buffer Treatment

مقالات ذات صلة