$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. تنقية الأجسام المضادة عن طريق كروماتوغرافيا التقارب باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائل السريع للبروتين الآلي (FPLC)
ملاحظة: يمكن تطبيق الإجراء التالي بشكل عام على معظم الأنظمة الآلية. يمكن إجراء التنقية في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية (إذا تم الاحتفاظ بنظام FPLC في غرفة باردة). يمكن إجراء سلسلة من اختبارات الاستكشاف لتحديد ظروف التنقية المثلى بما في ذلك مصفوفة العمود المناسبة ، ومخزن الربط ، ومخزن الشطف ، ودرجة الحموضة لضمان أقصى قدر من الاسترداد للأجسام المضادة المنقاة من الوسائط المكيفة (راجع قسم النتائج). تعتمد الظروف المثلى على الجسم المضاد أو البروتين الذي يتم تنقيةه. تم إجراء عمليات التنقية على نظام FPLC الآلي. تم إجراء عمليات التنقية في درجة حرارة الغرفة باستخدام عمود بروتين أ سعة 5 مل.
- قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية باستخدام الماء فائق النقاء واضبطه على درجة الحموضة الموصى بها ثم قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
- قم بإعداد 1 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4 (مخزن مؤقت ملزم) عن طريق خلط ما يلي: 0.14 M كلوريد الصوديوم ، 0.0027 M KCl ، 0.01 M Na2HPO4 و 0.001 M KH2PO4. اضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر قبل تصفية المخزن المؤقت.
- تحضير 500 مل من 0.1 م جلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.7 (عازلة الشطف). اضبط درجة الحموضة قبل تصفية المخزن المؤقت.
- تحضير 50 مل من 1 M Tris pH 9.0 (المخزن المؤقت للتحييد).
- تأكد من إجراء جميع توصيلات الطاقة والاتصالات بالكمبيوتر بالكمبيوتر. يجب أن تكون الأجهزة مرئية في وحدة "التحكم في النظام" للبرنامج. تأكد من ضبط خلية الأشعة فوق البنفسجية على الطول الموجي 280 نانومتر. اختياري: معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إذا كان متصلا وسيتم استخدامه.
- اغمر أنابيب مدخل A و B ومضخة العينة في ماء عالي النقاء لغسل النظام. قم بتطهير المضخات بحقنة إذا كان هناك هواء في الأنبوب أو اشتباه في وجود هواء في النظام. اغسل النظام بالماء عن طريق التشغيل اليدوي عبر وحدة التحكم في النظام أو عبر طريقة آلية. لاحظ أن الضغط والتوصيل وتتبع الأشعة فوق البنفسجية 280 ودرجة الحموضة تظل ثابتة وأن حد الضغط للعمود لا يتم تجاوزه وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
ملاحظه: قد تشير التشوهات إلى وجود هواء أو انسداد في النظام يجب معالجته قبل المتابعة.
- في وحدة وحدة التحكم في النظام، ابدأ معدل التدفق بمعدل 1 مل/دقيقة يدويا عبر المضخة A في أي من الحمل (تجاوز حلقة العينة) أو الحقن (من خلال حلقة العينة) لبدء توصيل العمود. افصل أنابيب النظام عند مدخل موضع العمود وقم بإزالة السدادة المتصلة بمدخل العمود.
- اسمح للمياه بالتدفق من أنابيب النظام بالتنقيط أعلى العمود ثم قم بتوصيل أنبوب النظام بالعمود. يضمن وجود مدخل ومدخل العمود يفيض بقطرات الماء اتصالا خاليا من فقاعات الهواء.
- قم بتوصيل مخرج العمود عند مخرج المصب وتحقق من تثبيت جميع التركيبات بإحكام. مع إرفاق العمود الآن بالنظام ، لا تتجاوز حدود الحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق كما هو موضح في مواصفات العمود.
- اغسل العمود ب 5 أحجام أعمدة (CV) من الماء. إذا لزم الأمر ، استمر في غسل العمود حتى يستقر تتبع الأشعة فوق البنفسجية 280.
- اغمر أنابيب مدخل A في المخزن المؤقت الملزم، B في المخزن المؤقت Elution ومضخة العينة في المخزن المؤقت الملزم لموازنة النظام في المخازن المؤقتة الصحيحة. املأ أنابيب المدخل بالمخزن المؤقت باستخدام PumpWash عن طريق التشغيل اليدوي.
- في وحدة "محرر الطريقة" للبرنامج ، استخدم معالج الطريقة لإعداد طريقة كروماتوغرافيا التقارب للعمود المراد استخدامه.
ملاحظه: تأتي أنظمة FPLC الآلية بطرق مملوءة مسبقا بالإعدادات الموصى بها (أي معدل التدفق وحد الضغط) وتقوم بخطوات التشغيل بناء على العمود (الشركة المصنعة والمصفوفة والحجم) المحدد للتنقية.
- استخدم خطوات التشغيل التالية لكروماتوغرافيا تقارب البروتين A:
- نظام التوازن مع 5 سيرة ذاتية من المخزن المؤقت الملزم وجمع التدفق في حاوية النفايات.
- قم بتحميل العينة على العمود (يتم تحديد وحدة التخزين المراد تحميلها يدويا في الطريقة) وتجميع التدفق في حاوية منفصلة.
- اغسل النظام ب 5 سيرة ذاتية من المخزن المؤقت الملزمة واجمع التدفق في حاوية منفصلة.
- عمود Elute مع 5 تجزئة متساوية CV باستخدام المخزن المؤقت Elution وجمع عينة الأجسام المضادة المنقاة ككسور بواسطة مجمع الكسور.
- نظام التوازن مع 5 سيرة ذاتية من المخزن المؤقت الملزم وجمع التدفق في حاوية النفايات.
- بمجرد إعداد الطريقة ، حدد حجم الوسائط الشرطية المراد تطبيقها على العمود واحفظ الطريقة.
ملاحظه: يجب أن يكون الحجم المحدد في الطريقة أقل من 5-10 مل من الحجم الفعلي لتجنب دخول الهواء أثناء تشغيل العينة. الحجم المحدد المستخدم في هذا البروتوكول هو 90-120 مل.
- اغمر أنبوب مضخة العينة في الوعاء الذي يحتوي على الوسائط المكيفة.
- قم بإعداد حاوية منفصلة لجمع تدفق العينة عبر أنبوب المخرج المحدد.
ملاحظه: من المهم تجميع التدفق في حالة حدوث خطأ أثناء التشغيل أو تجاوز سعة ربط العمود مما يتطلب إعادة تطبيق التدفق على العمود أو تكرار التنقية.
- تحضير أنابيب التجميع في مجمع الكسر. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحييد لكل حجم كسر 1 مل. سيقوم نظام FPLC تلقائيا بمسح الكسور في أنابيب التجميع.
- في وحدة "التحكم في النظام" الخاصة بالبرنامج، افتح الطريقة المراد تشغيلها.
ملاحظه: يتم بدء تشغيل الطريقة في سلسلة من الصفحات التي تتضمن التحقق من متغيرات الطريقة وإعداد مجمع الكسور وتحديد اسم ملف النتيجة وموقع التخزين.
- انقر فوق START لبدء التشغيل. يمكن مراقبة التشغيل في وحدة "التحكم في النظام".
- عند الانتهاء من تشغيل التنقية ، تحقق من الكروماتوگرام الناتج في وحدة "التقييم" في برنامج النظام.
- اجمع جميع الكسور المحتوية على البروتين في أنبوب منفصل ، وتبادل العازلة والتركيز في PBS باستخدام جهاز مرشح الطرد المركزي بوزن جزيئي 30 كيلو دالتون. قم بتنفيذ خطوات الطرد المركزي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قم بقياس تركيز الأجسام المضادة باستخدام مقايسة حمض البيسنكونينيك (BCA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إذا كان سيتم إجراء تشغيل تنقية آخر ، فقم بتجهيز أنبوب مضخة العينة في المخزن المؤقت الملزم وكرر الخطوات 1.9-1.14.
- عند الانتهاء من عمليات التنقية ، اغمر أنابيب مدخل A و B ومضخة العينة في ماء عالي النقاء واغسل النظام والعمود كما هو موضح في الخطوة 3.
- غمر A و B وأنابيب المضخة العينة في 20٪ من الإيثانول وكرر إجراء الغسيل لتخزين النظام والعمود.
- افصل العمود عن مخرج المصب واستبدل سدادة العمود ، ثم افصل العمود عند المدخل واستبدل السدادة ، وأعد توصيل الأنبوب بالنظام. قم بتخزين العمود عند 4 درجات مئوية.