تقنية تلطيخ التألق المناعي للكشف عن تكوين الخلايا العصبية في الحصين لدى البالغين

الملخص

المصدر: Ansorg، A.، et al. الكيمياء المناعية ووضع العلامات المتعددة بالأجسام المضادة من نفس النوع المضيف لدراسة تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغين. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح الفيديو طريقة تلطيخ التألق المناعي المستخدمة لفحص تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغ. في البداية ، يخضع قسم دماغ الفأر للعلاج بالأجسام المضادة الأولية الموجهة إلى بروتينات العلامة المرتبطة بتكوين الخلايا العصبية في الخلايا السلفية العصبية. بعد ذلك ، يتم تصنيفها بأجسام مضادة ثانوية موسومة بالفلوروفورات. ثم تتم ملاحظة قسم الدماغ تحت المجهر متحد البؤر للتمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا السلفية ، بناء على أنماط التعبير عن مجموعات متميزة من بروتينات الواسم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title">1. تحضير الأنسجة

1. تحضير 4٪ فورمالديهايد في 0.1 M من الفوسفات المخزن الهيدروجيني 7.4 في اليوم السابق للتروية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. قم بنشر الفئران المخدرة بعمق عبر القلب (3.5٪ إيزوفلوران) عبر البطين الأيسر بمحلول ملحي مخمول بالفوسفات المثلج (PBS) ، ثم ب 40 مل من الفورمالديهايد المثلج (معدل التدفق 5 مل / دقيقة). قم بتشريح الدماغ وقم بإصلاحه بعد ذلك في نفس المثبت لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
3. انقل الأدمغة على التوالي إلى 10٪ (24 ساعة عند 4 درجات مئوية) و 30٪ سكروز (حتى يغرق الدماغ ، حوالي 48 ساعة). للتجميد ، اغمر الأدمغة المحمية بالتبريد ببطء في -25 درجة مئوية من الأيزوبنتان حتى لا تخرج فقاعات من الأنسجة. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
4. قطع المقاطع الإكليلية بسمك 40 ميكرومتر على ميكروتوم متجمد (درجة حرارة الكتلة عند -25 إلى -16 درجة مئوية). نقل الأقسام بالتتابع إلى محلول مضاد للتجمد يحتوي على آبار من صفيحة زراعة خلية مكونة من 24 بئرا (انظر الشكل 1). يحفظ في -20 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. تلطيخ المناعة

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تتم معالجة الأقسام عائمة بحرية ، عادة في ألواح ذات 6 آبار مجهزة بلوحة حاملة وإدخالات شبكية. كاستثناء ، يتم إجراء تفاعلات الحجب وحضانات الأجسام المضادة ومركب أفيدين بيوتين (ABC) في ألواح ذات 12 أو 24 بئرا بدون إدخالات شبكية (0.5 إلى 1 مل لكل بئر كافية ، اعتمادا على عدد الشرائح التي يجب تلطيخها). خلال هذه الخطوات ، قم بنقل الأقسام بمساعدة فرشاة دقيقة (اشطفها بكل محلول جديد). تتم جميع الحضانات مع التحريض المستمر (بحد أقصى 150 دورة في الدقيقة).

1. الكيمياء المناعية (طريقة ABC)
   1. انقل الأجزاء من مضاد التجمد إلى محلول ملحي مخزن مؤقت (TBS) واشطفها جيدا (مرة واحدة O/N عند 4 درجات مئوية، 5 مرات في درجة حرارة الغرفة [RT] لمدة 10 دقائق لكل منها) لإزالة مضاد التجمد تماما.
   2. لإخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي ، احتضن لمدة 30 دقيقة في 1.5٪ H₂O₂ في TBS-Tween 20 (TBS-T). انتبه إلى أقسام الفقاعات وإعادة الغمر إذا لزم الأمر. اشطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
   3. اختياري: في هذه الأثناء ، قم بتسخين خزانة التدفئة و 2 نيوتن حمض الهيدروكلوريك إلى 37 درجة مئوية. لتشويه الحمض النووي ، احتضن الأقسام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 2 N HCl. افصل الأقسام برفق بمساعدة فرشاة.
   4. اختياري: قم بتحييد الأقسام لمدة 10 دقائق في 0.1 متر البورات المخزن الهيدروجيني 8.5 ، RT. أثناء النقل ، امسح لفترة وجيزة الحشوات الشبكية التي تحتوي على الأقسام الموجودة على منشفة ورقية لإزالة مخلفات حمض الهيدروكلوراي. اشطف 2 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
   5. احتضن في TBSplus لاختراق الأنسجة ومنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة لمدة 1 ساعة في RT.
   6. احتضان الجسم المضاد الأولي المخفف في TBSplus ، O / N عند 4 درجات مئوية ، اشطفه 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
   7. احتضان في الجسم المضاد الثانوي الحيوي المخفف في TBSplus لمدة 3 ساعات في RT. اشطفه 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما. في غضون ذلك ...
   8. تحضير مركب ABC وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (1٪ A + 1٪ B في TBS-T). اتركيه لمدة 30 دقيقة في RT قبل الاستخدام. احتضان الأقسام في كاشف AB لمدة 1 ساعة في RT. اشطفها 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منها.
   9. تحضير 50 مل 0.5 مجم / مل 3،3 ′-ديامينوبنزيدين (DAB) في TBS-T لكل طبق 6 أو 12 بئرا ، مقسمة إلى نصفين ، وماصة 4 مل أو 2 مل لكل بئر ، على التوالي. نقل الأقسام إلى حل DAB (تنبيه! DAB سامة. اتبع MSDS المحددة التي يوفرها المورد ، أي ارتداء معطف المختبر والقفازات واستخدام غطاء الدخان الكيميائي).
   10. أضف 0.5 مل 1٪ H₂O₂ إلى محلول DAB المتبقي سعة 25 مل ، واخلطه ، وأحجام مكافئة للماصة كما هو مذكور أعلاه لكل بئر لبدء تفاعل البيروكسيداز. احتضان لمدة 12 دقيقة. اشطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
   11. قم بتركيب الأقسام على الشرائح في الجيلاتين وتجفيف الهواء O / N. غطاء مع وسط تركيب دائم.
   12. اختياري: Counterstain قبل وضع الغطاء.
       ملاحظه: إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة بسبب الخلفية العالية، كرر المعالجة H₂O₂ بعد الحضانة باستخدام كاشف AB (الخطوة 2.1.8).
2. التألق المناعي المتعدد
   1. التألق المناعي المتعدد أحادي أو متزامن
      1. انقل الأجزاء من مضاد التجمد إلى TBS واشطفها جيدا (مرة واحدة O/N عند 4 درجات مئوية، 5 مرات عند RT لمدة 10 دقائق لكل منهما) لإزالة مضاد التجمد تماما.
      2. اختياري: كخطوات 2.1.3 - 2.1.4.
      3. احتضان في TBSplus لاختراق الأنسجة ومنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة ، 1 ساعة في RT.
      4. احتضن في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال ، الفئران α-BrdU (برومودوكسي يوريدين) ، خنزير غينيا α-DCX (دبل كورتين) ، الماعز α-GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر)) المخفف في TBSplus ، O / N عند 4 درجات مئوية. اشطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
      5. احتضن في مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروكروم (على سبيل المثال ، Rhodamine Red α-rat ، Alexa-647 α-guinea pig ، Alexa-488 α-goat ؛ كلها مشتقة من الحمار) مخففة في TBSplus ، 3 ساعات في RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. من الآن فصاعدا حماية الأقسام من الضوء. اشطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
      6. قم بتركيب الأقسام على الشرائح في الجيلاتين وتجفف في الهواء طوال الليل (O / N). غطاء مع وسط تركيب مائي.
   2. التألق المناعي المتعدد المتسلسل مع الأجسام المضادة الأولية من نفس النوع المضيف
      1. () كخطوات 2-2-1-1 - 2-2-1-3.
      2. احتضان في أول جسم مضاد أولي (على سبيل المثال ، أرنب α-مستضد A) ، O / N عند 4 درجات مئوية. اشطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقائق لكل منهما.
      3. احتضان في أول جسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروكروم (على سبيل المثال ، Rhodamine Red-conj. حمار α-rabbit) ، 3 ساعات RT. من الآن فصاعدا ، قم بحماية الأقسام من الضوء. اشطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقائق لكل منهما.
      4. احتضان في مصل طبيعي بنسبة 10٪ من نفس المضيف مثل الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال ، مصل الأرانب) لمدة 3 ساعات RT لتشبع الباراتوبات المفتوحة على الجسم المضاد الثانوي الأول. اشطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقائق لكل منهما.
      5. احتضن في TBSplus مع 50 ميكروغرام / مل شظايا Fab أحادية التكافؤ غير المترافقة موجهة ضد مضيف الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال ، α أرنب IgG (H + L)) لتغطية الحلقات التي يمكن التعرف عليها بواسطة الجسم المضاد الثانوي الثاني ، O / N عند 4 درجات مئوية.
      6. اشطف 3 مرات على الأقل في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقائق لكل منهما. أثناء النقل ، امسح لفترة وجيزة الحشوات الشبكية التي تحتوي على الأقسام الموجودة على منشفة ورقية لإزالة أي مغادرات Fab.
      7. احتضان الجسم المضاد الأولي الثاني (على سبيل المثال ، الأرانب α-مستضد B) ، O / N عند 4 درجات مئوية. اشطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقائق لكل منهما.
      8. احتضان في الجسم المضاد الثانوي الثاني المترافق بالفلوروكروم (على سبيل المثال ، Alexa-488-conj. donkey α-rabbit) ، 3 ساعات RT. اشطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما ، ثم قم بالتركيب والغطاء على النحو الوارد أعلاه.
         ملاحظه: لتسمية المستضدات بالأجسام المضادة من الأنواع المضيفة المختلفة ، أضفها إلى الخطوة 2.2.2.2 والأجسام المضادة الثانوية المعنية إلى الخطوة 2.2.2.3.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. رسم تخطيطي لنقل شرائح ميكروتوم إلى طبق 24 بئرا. ابدأ من A1 وضع الشرائح اللاحقة في الصف A ؛ بعد A6 ، انتقل إلى الصف التالي B ، وهكذا دواليك. عند الوصول إلى D6 ، ارجع إلى A1 واستمر. يسمح ترتيب الشرائح هذا بالقياس الكمي^{لكل قسم n} من الدماغ بأكمله. لتقدير الخلايا حديثي الولادة ، خذ كل 6^{أقسام دماغية} (أي ما يعادل محتوى عمود واحد) ؛ للتنميط الظاهري للتأمل المناعي ، خ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تحضير الأنسجة إيزوفلوران أكتافيس بيرامال للرعاية الصحية 700211 مسحوق بارافورمالدهيد (PFA) ريدل دي هاين 16005 سامة وقابلة للاشتعال مضخة التروية PD5206 أدوات هايدولف 523-52060-00 أنابيب مختبر Masterflex Tygon ، Ø 0.8 مم ثيرمو فيشر العلمي 06409-13 إبرة الرضاعة، مستقيمة، 21 جم، رأس زيتون 1.75 مم، 40 مم أنثوس 1036 تجميد ميكروتوم ميكروم HM 400 ثيرمو فيشر العلمي 24-بئر زراعة الخلية لوحات متعددة الآبار غرينر بيو ون 662160 [م] الكيمياء المناعية باخرة تيفال فيتاكوزن تيفال في إس 4001 إدراج غشاء شبكي من البوليستر Netwell مقاس 24 مم كورنينج 3479 محملة مسبقا في ألواح ثقافة 6 آبار إدراج غشاء شبكي من البوليستر Netwell مقاس 15 مم كورنينج 3477 محملة مسبقا في ألواح استزراع 12 بئرا طقم ناقل بلاستيك Netwell 6 آبار كورنينج 3521 لإدراج غشاء شبكي بوليستر 24 مم طقم ناقل بلاستيك Netwell 12 بئر كورنينج 3520 لإدراج غشاء شبكي بوليستر 15 مم مجموعة Vectastain Elite ABC مختبرات ناقلات PK-6100 DAB (3،3 ′-هيدرات ديامينوبينزيدين رباعي هيدروكلوريد) سيجما ألدريتش د-5637 مادة مسرطنة وحساسة للضوء فلوروماونت-جي الجنوب الحيوي 0100-01 الأجسام المضادة الأولية أرنب IgG1 α-Ki67 أرنب α-GFAP ، AS-3-GF نوفوكاسترا / لايكا بيوأنظمة NCL-L-Ki67MM1 DAB 1: 400 / IF 1: 100 ؛ يتطلب استرجاع الحاتمة الماعز IgG (H + L) α-GFP الأنظمة المشبكية 173 002 09:20 الماوس IgG1 α-nestin الأجسام المضادة للأكرس R1091P 06:00 خنزير غينيا IgG (H + L) α-Doublecortin أبكام أب6142 1: 200 ؛ يتطلب استرجاع الحاتمة الفئران IgG2a α-BrdU (الاستسقاء) ميرك ميليبور أ ب 2253 09:20 الجرذ IgG2a α-BrdU (منقى) AbD سيروتيك / بيو راد OBT0030CX للكشف عن BrdU ؛ دب 1:500/إذا 1:400 الماوس IgG1κ α-BrdU AbD سيروتيك / بيو راد OBT0030 للكشف عن CldU ؛ DAB 1: 500 / IF 1: 250-400 الماوس IgG1 α-NeuN BD Biosciences 347580 للكشف عن IdU ؛ DAB 1:500/IF 1:350 الأجسام المضادة الثانوية ميرك ميليبور MAB377 09:20 حمار α خنزير غينيا IgG (H + L) - البيوتين حمار α الفئران IgG (H + L) - البيوتين ديانوفا 711-065-152 09:20 حمار α فأر IgG (H + L) - بيوتين ديانوفا 712-065-150 09:20 الماعز α الفئران IgG (H + L) - Alexa Fluor 488 ديانوفا 715-065-151 09:20 حمار α ماعز IgG (H + L) - Alexa Fluor 488 المجسات الجزيئية أ 11006 05:10 حمار α فأر IgG (H + L) -FITC ، فاب فرغينت المجسات الجزيئية أ 11055 05:10 حمار α ماوس IgG (H + L) - Alexa Fluor 647 ديانوفا 715-097-003 02:40 حمار α خنزير غينيا IgG (H + L) - Alexa Fluor 647 ديانوفا 715-605-151 05:10 حمار α الفئران IgG (H + L) - رودامين أحمر X ديانوفا 706-605-148 05:10 حمار α أرنب IgG (H + L) - رودامين أحمر - X ديانوفا 712-295-150 05:10 حمار α خنزير غينيا IgG (H + L) - رودامين أحمر - X ديانوفا 711-295-152 05:10 ستربتافيدين رودامين ريد إكس ديانوفا 706-296-148 05:10 الماعز α الأرانب IgG (H + L) - AMCA ديانوفا 016-290-084 09:20 هوشت: 33342 ديانوفا 111-155-144 1: 250 ، يعمل فقط مع الأرانب α-GFAP دابي المجسات الجزيئية H3570 17:40 حظر المجسات الجزيئية د1306 17:40 حمار فاب شظية α فأر IgG (H + L) حمار شظايا α أرنب IgG (H + L) ديانوفا 715-007-003 01:20 مصل الحمار العادي ديانوفا 711-007-003 01:20 مصل الأرانب العادي ميرك ميليبور S30 مصل الماعز العادي ديانوفا 011-000-010 ألبومين مصل الأبقار ديانوفا 005-000-001 علم الأنسجة سيجما ألدريتش أ 7906 كريسيل البنفسجي نيو كلير سيجما ألدريتش سي 5042 نيو ماونت ميرك ميليبور 109843 بديل الزيلين غير السام مجهريه ميرك ميليبور 109016 وسط تركيب دائم أكسيوسكوب 2 LSM 710 الفحص المجهري لكارل زايس الفحص المجهري لكارل زايس