تقنية وضع العلامات المناعية لتصور التوطين الخلوي للبروتينات

Abstract

المصدر: Aishwarya، R.، et al. تصور التوطين تحت الخلوي لبروتين في القلب باستخدام وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية متبوعا بالفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تقنية للوسم المناعي لمستقبلات سيجما -1 في قسم أنسجة قلب الفئران باستخدام النقاط الكمومية. يتم إصلاح أنسجة القلب ، وتتناغمها ، وملطخة ، وتجفيفها ، ومغروسة في الراتنج ، ثم يتم تقسيمها. ثم تتم معالجة الأقسام بالأجسام المضادة وتصنيفها بنقاط كمومية لتحديد التوطين الخلوي لمستقبلات Sigma-1 باستخدام المجهر الإلكتروني.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تحضير

1. تخدير الفئران باستخدام 3٪ إيزوفلوران. افتح الصدر عن طريق عمل شق أفقي في المنطقة فوق منتصف البطن وسحب الجلد. قم بعمل شق آخر بعناية لفتح تجويف الصدر دون ثقب أي أعضاء أخرى.
   1. قم بنقف القلب من خلال القمة أولا ثم البطين الأيمن باستخدام الجلوتارالديهايد البارد 3٪ في محلول القلبي (50 ملي مولار KCl ، 5٪ سكر العنب في PBS ، انظر الجدول 1) لمدة دقيقتين لضمان استرخاء عضلة القلب الكامل.
2. قم بتنقيم القلب باستخدام الجلوتارالديهايد المثلج المثلج بنسبة 3٪ في 0.1 متر من محلول كاكوديلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة دقيقتين أخريين. باستخدام ضغط الجاذبية ، استخدم إبرة 25 جم 5/8 بوصة لإدخال المثبتات في القلب. مباشرة بعد أن يبدأ القلب في الامتلاء بالمثبت ، ارفع قمة القلب واقطع الأوعية الموجودة تحتها على بعد 1-2 مم من القلب لتخفيف الضغط والسماح للسوائل بالتصريف.
3. قم بتشريح القلب وإزالة الأذينين وإسقاط البطينين في محلول مثلج 3٪ جلوتارالديهايد / 0.1 مليون كاكوديلات الصوديوم في طبق بتري. قم بعمل قطع فراشة بعد 30-60 دقيقة من التثبيت وضعها في طبق بتري يحتوي على 3٪ جلوتارالديهايد / كاكوديلات (انظر جدول المواد). يقطع القلب باستخدام شفرة جراحية في مكعبات صغيرة بحجم 1 مم³ أثناء وجوده في محلول الجلوتارالديهايد / الكاكوديلات.
4. قم بإصلاح / اغمر أنسجة القلب المقطعة في محلول الجلوتارالديهايد / الكاكوديلات لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.

فئة < p = "jove_title" >2. معالجة أنسجة القلب

1. بعد 24 ساعة من التثبيت ، اغسل الأنسجة في 0.1 متر من محلول كاكوديلات الصوديوم لمدة 20 دقيقة.
   1. قم بإعداد عازلة كاكوديلات 0.1 متر باتباع الخطوات أدناه.
      1. لتحضير عازلة كاكوديلات الصوديوم 0.1 M ، قم بإعداد مخزون من 1 M cacodylate الصوديوم عن طريق إذابة محلول كاكوديلات الصوديوم (21.4 جم) و 1٪ محلول كلوريد الكالسيوم (3 مل) في 90 مل من الماء المقطر. ارفع حجم المحلول إلى 100 مل عن طريق إضافة الماء المقطر. قلب المحلول جيدا واتركه طوال الليل لإذابة المذاب.
      2. بعد ذلك ، خذ 10 مل من محلول مخزون الكاكوديلات الصوديوم 1 م وأضفه إلى 80 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وحجمه يصل إلى 100 مل عن طريق إضافة الماء المقطر.
2. كرر الغسيل في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M لمدة 20 دقيقة أخرى. قم بإزالة الأنسجة من محلول كاكوديلات الصوديوم واغمرها في محلول رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 2٪ لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. هذه العملية تسمى الترجح.
   1. تحضير محلول رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ باتباع الخطوات أدناه.
      1. لتحضير محلول رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 2٪ ، خذ محلول رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 4٪ ، و 4 مل (انظر جدول المواد) ، و 1 م من محلول مخزون الكاكوديلات الصوديوم (0.8 مل) ، والماء المقطر (3.2 مل) لصنع إجمالي 8 ><مل من المحلول. ملاحظه: يجب تنفيذ هذه العملية برمتها والخطوات من الآن فصاعدا في غطاء الدخان.
3. بعد التذبذب ، اغمر الأنسجة في محلول أسيتات الصوديوم 2٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   1. تحضير محلول أسيتات الصوديوم 2٪ عن طريق إذابة 4 جم من أسيتات الصوديوم في 20 مل من الماء المقطر.
4. بعد ذلك ، اغمر الأنسجة في محلول أسيتات اليورانيل بنسبة 2٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   1. تحضير محلول أسيتات اليورانيل 2٪ عن طريق إذابة 4 جم من أسيتات اليورانيل في 20 مل من الماء المقطر.
5. بعد تلطيخ أسيتات اليورانيل ، قم بتجفيف الأنسجة بالتتابع من خلال الكحوليات المتدرجة والأسيتون بالترتيب المذكور في الجدول 2.

< p class = "jove_title" >3. تضمين أنسجة القلب

1. قم بتضمين الأنسجة المجففة في راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة باتباع الخطوات أدناه.
   1. لصنع راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة ، امزج 10.24 مل من مونومر الايبوكسي ثنائي أكسيد السيكلوهكسين من الفينيل ، و 6.74 مل من ثنائي الجليسيديل الأثير من البولي بروبيلين جلايكول (DER 732) ، و 30.05 مل من أنهيدريد السكسينيك النونينيل (NSA) (انظر جدول المواد) في أنبوب سعة 50 مل. حرك المعلق جيدا باليد لمدة 2 دقيقة.
   2. أضف 18 قطرة من مسرع الإيبوكسي 2-ثنائي ميثيل أمينوإيثانول (DMAE ، انظر جدول المواد) وحرك التعليق لخلط المكونات جيدا.
   3. تشريب الأنسجة في راتنجات الايبوكسي في التسلسل التالي من الخليط.
      1. استبدل الأسيتون بنسبة 100٪ براتنج 1: 1: تعليق الأسيتون واغمر الأنسجة فيه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
      2. استبدل الراتنج 1: 1: تعليق الأسيتون براتنج 6: 1: تعليق الأسيتون واغمر الأنسجة فيه لمدة 3 ساعات.
      3. أخيرا ، استبدل راتنج 6: 1: تعليق الأسيتون بتعليق راتنج 100٪ واترك الأنسجة مغمورة فيه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
2. ضع الأنسجة في راتينج طازج في قوالب دقيقة مقاس 8 مم (انظر جدول المواد) وقم بمعالجة الأنسجة المضمنة عند 70 درجة مئوية طوال الليل><. ملاحظه: تأكد من أن الراتنج صلب ولكنه ليس هشا بعد المعالجة.

< p class = "jove_title" >4. تقطيع الأنسجة باستخدام الميكروتوم الفائق

1. قم بقص كتل الراتنج مع الأنسجة بحيث لا يزيد حجمها عن 1 مم قبل تركيبها على الميكروتوم الفائق (انظر جدول المواد). ضع القالب بأكبر قدر ممكن من الدقة في الذراع المجزأ للميكروتوم الفائق وقم بتقديم قالب العينة يدويا نحو السكين الماسي.
2. قم بقص الأقسام بسمك 500 نانومتر (نصف ميكرون) بسكين Histo (انظر جدول المواد) ، وباستخدام أداة حلقة EM ، التقطها وضعها على شريحة زجاجية.
3. ضع الشريحة الزجاجية على لوح ساخن لصبغة تولويدين الزرقاء للعثور على منطقة الاهتمام.
4. بعد العثور على منطقة الاهتمام ، استخدم سكينا Ultra 45 درجة (انظر جدول المواد) لإنتاج مقاطع رفيعة جدا من الذهب الباهت (100 نانومتر). ضع هذه الأقسام فائقة النحافة على الجانب الباهت من شبكة نحاسية 200 شبكة.

فئة < p = "jove_title" >5. تلطيخ قسم القلب الرقيق

للغاية

1. ابدأ التلوين عن طريق كشف المستضد باستخدام محلول النقش ، أي محلول ميتا بريدات الصوديوم بنسبة 5٪.
   1. تحضير 500 ميكرولتر من محلول ميتابريدات الصوديوم بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد) في الماء المقطر.
      ملاحظه: تحضير محلول طازج قبل الاستخدام.
   2. ضع 20 ميكرولتر من محلول ميتابريدات الصوديوم على فيلم بارافين نظيف. ضع الشبكات المجففة تماما مع أقسام الأنسجة على قطرة محلول النقش.
      ملاحظه: يجب أن يكون الجانب الباهت من الشبكة مع قسم الأنسجة متجها نحو محلول النقش.
   3. اترك شبكة القسم على المحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. اغسل قسم المناديل المحفورة بوضعه على قطرة من الماء المقطر لمدة 60 ثانية.
3. قم بسد الألدهيدات المتبقية عن طريق وضع شبكات المقطع على قطرة من محلول الجلايسين 0.05 M لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. امسح حواف الشبكة على ورق الترشيح لإزالة محلول الجلايسين المتبقي.
   1. تحضير محلول جلايسين 0.05 م (انظر جدول المواد) عن طريق إذابة 3.75 مجم من الجلايسين في 1 مل من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
4. ضع شبكات المقطع في 10-20 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: تكوين محلول الحظر: 2 ميكرولتر من مصل الماعز العادي 1٪ (NGS) + 20 ميكرولتر من 1٪ BSA (التركيز النهائي: 10٪) + 178 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) لعمل حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر.
5. امسح حواف الشبكة على ورق الترشيح وضع قسم الشبكة على مخفف الجسم المضاد للتكييف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
6. احتضان أقسام الشبكة بالجسم المضاد الأولي (Sigmar1 في هذه الحالة ، انظر جدول المواد ؛ مخفف 1:10 في مخفف الجسم المضاد) لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة في غرفة رطبة.
7. جفف الشبكة واغسل أقسام الشبكة بمخفف الأجسام المضادة مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
8. احتضان أقسام الشبكة بجسم مضاد ثانوي بيوتينيل (في هذه الحالة ، جسم مضاد ثانوي متعدد النسيلة مضاد للأرانب من الماعز الحيوي ، انظر جدول المواد ؛ مخفف 1:10 في مخفف الجسم المضاد) لمدة 1 ساعة في غرفة رطبة.
9. جفف الشبكة واغسل أقسام الشبكة بمخفف الأجسام المضادة مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
10. احتضان أقسام الشبكة في QD المترافق بالستربتافيدين المتاح تجاريا (_{QD 655nm} ، انظر جدول المواد ؛ مخفف 1:10 في مخفف الجسم المضاد) لمدة 1 ساعة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. منع التعرض للضوء عن طريق تغطية الغرفة بورق الألمنيوم.
11. جفف حواف الشبكة باستخدام ورق الترشيح واغسل أقسام الشبكة عن طريق وضعها على قطرات الماء لمدة دقيقتين.
12. امسح حواف الشبكة حتى تجف.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تكوين PBS والمحاليل الأخرى المستخدمة لجفاف الأنسجة.

مخزن مؤقت تكوين كم محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1x) (1 لتر) كلوريد الصوديوم 8 جرام كلوريد البوتاسيوم 0.2 جرام فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة 1.44 جرام فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة 0.24 جرام اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 < p class = "jove_content" >الجدول 2: تطبيق الكحول المتدرج والأسيتون لجفاف الأنسجة (الخطوة 2.5)

مكون الوقت 50٪ إيثانول 10 دقائق 70٪ إيثانول 10 دقائق 95٪ إيثانول 10 دقائق 100٪ إيثانول 20 دقيقة 100٪ إيثانول 20 دقيقة 100٪ أسيتون 30 دقيقة 100٪ أسيتون 30 دقيقة

Materials