مقالة منهجية

تقنية تلطيخ الأعضاء بالكامل للتصوير ثلاثي الأبعاد للكلى

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hasegawa، S.، et al. تلطيخ الكلى بالكامل ثلاثي الأبعاد مع CUBIC. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتلوين كلى الفئران بالكامل باستخدام طريقة تطهير الأنسجة تسمى CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة ودون عائق والتحليل الحسابي) وتلوين الفلورسنت المناعي. تخضع الكلية لإزالة الأنسجة ، حيث يتم إزالة الدهون من الكلى وإزالة لونها ومعالجتها بمحلول مطابقة معامل الانكسار لجعل الأنسجة شفافة للحصول على التصوير ثلاثي الأبعاد الأمثل. الأنسجة ملطخة بأجسام مضادة مصنفة بالفلورسنت للكشف عن الأعصاب والشرايين الودية في الأنسجة تحت مجهر الألواح الضوئية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير وتثبيت الكلى

  1. قم بإجراء تثبيت التروية باتباع الخطوات أدناه.
    1. تخدير الفأر عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (3٪ ، 2.0 لتر / دقيقة) وإعطاء هيدروكلوريد ميديتوميدين (0.3 مجم / كغ) ، طرطرات البوتورفانول (5 مجم / كغ) ، وميدازولام (4 مجم / كغ) (انظر جدول المواد).
    2. قم بتفريخ ب 20 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4) و 30 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في عازلة الفوسفات (PB) من خلال البطين الأيسر للقلب.
  2. قم بإجراء تثبيت الغمر مباشرة بعد تثبيت التروية وأخذ عينات الكلى.
    1. اغمر الكلية في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة إضافية ، ثم اغسلها باستخدام PBS لمدة ساعتين (ثلاث مرات) 9 (الشكل 1).
      أنذر: الفورمالديهايد وبارافورمالدهيد مهيجات سامة. تعامل مع الكواشف في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
< ص الفئة = "jove_title" >2. إزالة اللون وإزالة الدهون

  1. قم بإعداد CUBIC-L (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة والخالية من العوائق والتحليل الحسابي) لإزالة اللون وإزالة الدهون التي تتكون من 10٪ بالوزن من Triton X-100 و 10٪ بالوزن من N-buthyldiethanolamine (انظر جدول المواد) ، بعد التقارير المنشورة مسبقا.
  2. قم بإجراء إزالة اللون وإزالة الدهون بواسطة CUBIC-L باتباع الخطوات أدناه.
    1. اغمر الكلية الثابتة في 7 مل من 50٪ (حجم / حجم) CUBIC-L (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-L) في أنبوب دائري القاع سعة 14 مل (انظر جدول المواد) مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات (الشكل 2 أ). ثم اغمرها في 7 مل من CUBIC-L في أنبوب دائري القاع سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
    2. قم بتحديث CUBIC-L كل يوم خلال هذه العملية. بعد عملية إزالة اللون وإزالة الشحوم ، اغسل الكلى باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين (ثلاث مرات) (الشكل 1). استخدم ملعقة توزيع لمعالجة العينات (الشكل 2 ب).
فئة < p = "jove_title" >3. تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل

  1. تحضير المخازن المؤقتة للتلطيخ.
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتلوين للأجسام المضادة الأولية عن طريق خلط 0.5٪ (حجم / حجم) Triton X-100 ، و 0.5٪ كازين في PBS ، و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
    2. قم بإعداد مخزن التلوين للأجسام المضادة الثانوية عن طريق خلط 0.5٪ (حجم / حجم) Triton X-100 و 0.1٪ كازين في PBS و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
  2. إجراء تلطيخ بالأجسام المضادة الأولية.
    1. تلطخ المناعة الكلى المخفضة للدهون بالأجسام المضادة الأولية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في مخزن التلوين عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف لمدة 7 أيام.
      ملاحظه: كمية المخزن المؤقت للتلطيخ اللازمة لكلية واحدة هي 500-600 ميكرولتر (الشكل 2 ج).
    2. اغسل الكلى باستخدام 0.5٪ (حجم / حجم) Triton X-100 في PBS (PBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد (الشكل 1).
  3. قم بتلطيخ الأجسام المضادة الثانوية.
    1. تلطيخ الكلى بأجسام مضادة ثانوية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في مخزن التلوين عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف لمدة 7 أيام. اغسل الكلى باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد (الشكل 1).
    2. بعد التثبيت ، اغمر الكلية في 1٪ فورمالديهايد في PB (خليط 1:36 من 37٪ فورمالديهايد و PB) لمدة 3 ساعات ، واغسلها باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات (الشكل 1).
< p class = "jove_title" >4. مطابقة معامل الانكسار (RI)

  1. تحضير CUBIC-R +.
    1. قم بإعداد CUBIC-R عن طريق خلط 45٪ بالوزن من 2،3-ثنائي ميثيل -1-فينيل -5-بيرازولون / أنتيبيرين و 30٪ بالوزن من النيكوتيناميد (انظر جدول المواد).
    2. قم بإعداد CUBIC-R + لمطابقة معامل الانكسار (RI) عن طريق إضافة 0.5 v٪ من N-buthyldiethanolamine إلى CUBIC-R بعد التقارير المنشورة سابقا.
  2. قم بإجراء مطابقة RI.
    1. اغمر الكلية في 7 مل من 50٪ (حجم / حجم) CUBIC-R + (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-R +) في أنبوب دائري القاع سعة 14 مل مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد. بعد ذلك ، اغمره في 7 مل من CUBIC-R + في أنبوب دائري القاع سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين (الشكل 1).
      ملاحظه: على الرغم من أن الكلية تطفو في 50٪ CUBIC-R + في بداية مطابقة RI ، إلا أنها تغرق وتصبح شفافة في CUBIC-R + في نهاية العملية (الشكل 2D).
< p class = "jove_title" >5. الحصول على الصور وإعادة بنائها

  1. اغمر الكلية المتطابقة مع RI في خليط من زيت السيليكون (RI = 1.555) والزيت المعدني (RI = 1.467) (55:45) أثناء الحصول على الصورة (RI = 1.51) (الشكل 3).
  2. احصل على صور ثلاثية الأبعاد للكلية بأكملها باستخدام مجهر فلورسنت صفائح ضوئية مصمم خصيصا (انظر جدول المواد). اجمع جميع بيانات الصورة الأولية بتنسيق TIFF 16 بت. تصور الصور المعروضة ثلاثية الأبعاد والتقطها باستخدام برنامج تحليل التصوير (Imaris ، انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تطهير الأنسجة وتلوين الفلورسنت المناعي بالكامل. تطهير الأنسجة بواسطة CUBIC هو عملية من خطوتين: مطابقة الدهون (CUBIC-L) ومطابقة معامل الانكسار (RI) (CUBIC-R +). يتم إجراء تلطيخ كامل بعد عملية إزالة الشحوم. شريط المقياس = 10 مم. الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 14 مل جولة القاع عالية الوضوح PP أنبوب اختبار صقر 352059 تنظيف الأنسجة ، تلطيخ ، غسل 2،3-ثنائي ميثيل -1-فينيل -5-بيرازولون / أنتيبيرين طوكيو للصناعة الكيميائية د1876 مكعب - R + 37٪ - محلول الفورمالديهايد ناكالاي تسك 16223-55 بعد التثبيت 4٪ - محلول عازلة فوسفات بارافورمالدهايد ناكالاي تسك 09154-85 تثبيت الكلى Alexa Flour 555 مترافق الحمار المضاد للأغنام IgG المضاد إنفيتروجين أ -21436 الجسم المضاد الثانوي (1:100) Alexa Flour 647 مترافق الحمار المضاد للأرانب IgG المضاد إنفيتروجين أ -31573 الجسم المضاد الثانوي (1:200) الجسم المضاد المضاد للأكوابورين 2 (AQP2) أبكام أب199975 الجسم المضاد الأولي (1:100) الجسم المضاد للبودوسين سيجما ألدريتش ص0372 الجسم المضاد الأولي (1:100) الأجسام المضادة للجلوكوز المضاد للصوديوم 2 (SGLT2) أبكام أب85626 الجسم المضاد الأولي (1:100) الأجسام المضادة لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) أبكام أب113 الجسم المضاد الأولي (1:100) الأجسام المضادة للأكتين المضادة للعضلات الملساء α (α-SMA) أبكام أب5694 الجسم المضاد الأولي (1:200) مانع الكازين في PBS ثيرمو فيشر العلمي 37528 تلطيخ المخزن المؤقت بوتورفانول طرطرات ميجي 5526 ريال مخدر C57BL / 6NJcl نيبون بيو سوب.سنتر غير متاح سلالة الفأر إيماريس Bitplane غير متاح برنامج تحليل التصوير مجهر التكبير الكبير أوليمبوس MVX10 وحدة المراقبة للمجهر المصمم خصيصا ميديتوميدين هيدروكلوريد كيوريتسو سياكو 8656 [م] مخدر ميدازولام ساندوز 27803229 مخدر الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش م 8410 زيت الغمر ن-بوثيل ديثانولامين طوكيو للصناعة الكيميائية ب 0725 مكعب L ، مكعب R + نيكوتيناميد طوكيو للصناعة الكيميائية N0078 مكعب - R + البولي إيثيلين جلايكول أحادي p-isooctylphenyl الأثير / Triton X-100 ناكالاي تسك 12967-45 مكعب L ، PBST زيت السيليكون HIVAC-F4 شين إيتسو كيميكال 50449832 زيت الغمر أزيد الصوديوم واكو 195-11092 تلطيخ المخزن المؤقت

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CUBIC

مقالات ذات صلة