مقايسة التألق المناعي للكشف عن مجاميع ألفا سينوكلين في قسم خزعة الجلد

الملخص

المصدر: Vacchi، E.، et al. استهداف مجاميع ألفا سينوكلين في الألياف العصبية الطرفية الجلدية عن طريق فحص التألق المناعي العائم الحر. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو مقايسة التألق المناعي للكشف عن مجاميع ألفا سينوكلين الخاصة بالأمراض التنكسية العصبية على أقسام خزعة الجلد. يتم استخدام التلوين المناعي العائم الحر لتسمية هيدرولاز الكربوكسيل الطرفي ومجاميع ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الجلدية. تحت المجهر متحد البؤر ، تشير الخلايا ذات التألق من كلا الأجسام المضادة إلى وجود مجاميع ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الجلدية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد ،

< p class = "jove_title" >1. مجموعة خزعة الجلد

1. دع الطبيب المؤهل يقوم بإجراء خزعة الجلد في بيئة سريرية مناسبة.
2. اختر المنطقة لإجراء خزعة الجلد ونظفها بمسحة كحولية.
3. تحضير محلول التخدير مع 1 سم مكعب من الليدوكائين 2٪.
4. مع الإبرة الموازية للمنطقة ، قم بحقن التخدير الموضعي تحت الجلد.
5. بعد التحقق من تأثير التخدير ، خذ الثقب القابل للتصرف مقاس 3 مم وقم بتطبيق ضغط دوراني ودقيق لأسفل لتدويرها لأسفل عبر البشرة والأدمة ، حتى يتم الوصول إلى الدهون تحت الجلد.
6. اسحب اللكمة.
7. استخدم ملقطا يمكن التخلص منه لسحب سدادة الجلد برفق.
8. استخدم المقص لقطع قاعدة العينة على مستوى الأنسجة الدهنية.
9. ضع العينة في أنبوب يحتوي على 10 مل من محلول التثبيت البريداتي ليسين بارافورمالدهيد (PLP).
10. تطهير المنطقة وقم بتغطيتها بضمادة لاصقة.

< p class = "jove_title" >2. تثبيت الأنسجة وتخزينها

1. اصنع محلول تثبيت PLP جديد (انظر الجدول 1).
2. مباشرة بعد جمع خزعة الجلد ، اغمرها في أنبوب يحتوي على 10 مل من محلول تثبيت PLP واحتضانها طوال الليل (O / N) عند 4 درجات مئوية.
3. في اليوم التالي ، تحت غطاء الدخان ، قم بإزالة مثبت PLP برفق وفي نفس الأنبوب ، اغسل الخزعة 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 5 مل من محلول سورنسن 0.1 M (الجدول 1).
4. تخلص من محلول سورنسن واحتضن الخزعة ب 5 مل من محلول الحماية من التبريد O / N عند 4 درجات مئوية.
5. قم بتخزين الخزعة عند 4 درجات مئوية إذا تم إجراء القطع باستخدام التبريد في غضون أسبوع واحد ؛ قم بتخزين الخزعة عند -20 درجة مئوية إذا تم إجراء القطع في غضون 3 أشهر ؛ قم بتضمين الخزعة في التبريد (الخطوات 3.2-3.4) وتخزينها عند -80 درجة مئوية للحفاظ عليها لفترة أطول من الوقت.

< p class = "jove_title" >3. قطع الأنسجة بالتبريد

1. اضبط التبريد على -20 درجة مئوية.
2. خذ مبردا واملأه بوسيط التضمين بالتبريد. تجنب تكوين الفقاعات.
3. باستخدام الملقط ، اغمر الخزعة في وسط التضمين بالتبريد مع المحور الطولي (البشرة - الأدمة) الموازي لقاع القالب بالتبريد.
قم
4. بتجميد العينة بالنيتروجين السائل للحصول على مكعب صلب من وسط التضمين بالتبريد الذي يحتوي على الخزعة في الاتجاه الصحيح.
5. ضع العينة في ناظم البرد وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للخزعة بالتأقلم.
6. ثبت العينة على ناظم البرد وقطع أقسام 50 ميكرومتر.
7. بمساعدة فرشاة صغيرة ، انقل الأقسام المبردة في صفيحة 96 بئر تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول مضاد للتجمد في كل بئر. قسم واحد لكل بئر.
8. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية
   ملاحظه: إذا لم يتم تحليل الخزعة بأكملها ، فقم بقصها جزئيا فقط. في هذه الحالة ، يجب تخزين الأقسام عند -20 درجة مئوية والجزء المتبقي من الخزعة عند -80 درجة مئوية للحفاظ عليها لفترة أطول من الوقت.

فئة

4. تلطيخ التألق المناعي

1. املأ لوحا سعة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
2. انقل الأقسام المراد تحليلها من لوحة التخزين إلى اللوحة الجديدة التي تحتوي على محلول الغسيل. 1 قسم لكل بئر (4 أقسام لكل موقع تشريحي ، لكل مريض: عادة ما يكون إجمالي 12 قسما لكل مريض).
3. اترك القسم في محلول الغسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). انقل القسم إلى بئر آخر يحتوي على نفس المحلول وكرر الغسيل.
4. انقل الأقسام إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول الحجب واحتضانها لمدة 90 دقيقة على الأقل ولمدة أقصاها 4 ساعات عند RT.
5. تمييع الأجسام المضادة الأولية المضادة ل PGP9.5 (الأرانب متعددة النسيلة ، 1: 1000) ومضادة ل 5G4 (أحادية النسيلة للفأر ، 1: 400) في محلول العمل.
6. انقل الأقسام إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول العمل للأجسام المضادة الأولية واحتضانها O / N في RT.
7. كخطوة 4.3 ، اغسل الأقسام مرتين لمدة 10 دقائق على الأقل في RT ، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
8. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (مترافقة مع فلوروفورات مختلفة) ومضاد للأرانب للماعز للكشف عن PGP9.5 (1: 700) ومضاد للماعز للكشف عن 5G4 (1: 700) في محلول العمل.
9. انقل الأقسام إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول العمل للأجسام المضادة الثانوية لمدة 90 دقيقة في RT. من هذه النقطة ، قم بتغطية لوحة البئر 96 بورق الألمنيوم لتجنب تبييض الفلوروفور المقترن بالأجسام المضادة الثانوية.
10. كخطوة 4.3 ، اغسل الأقسام مرتين لمدة 10 دقائق على الأقل ، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
11. انقل الأقسام إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، مخفف 1: 5,000 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] 1x) لمدة 5 دقائق في RT.
12. كخطوة 4.3 ، اغسل الأقسام مرتين لمدة 10 دقائق على الأقل ، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
13. قم بتركيب الأقسام على شريحة في الموضع الصحيح لتجنب الطي الخاطئ.
14. أضف بضع قطرات من وسط التثبيت على الشريحة وقم بتغطيتها بغطاء.
15. دع الشرائح تجف O / N قبل استخدام المجهر الكونفوكالي / الفلوري.
16. قم بتخزين الشرائح في صندوق مناسب عند 4 درجات مئوية لتجنب التعرض للضوء. إذا تم تخزينها بدقة ، فستكون الإشارة مرئية لمدة 6 أشهر تقريبا.
    ملاحظه: يتم نقل قسم من صفيحة البئر 96 التي تحتوي على الشرائح المقطوعة حديثا إلى لوحة البئر 96 التي تحتوي على محلول الغسيل (الخطوة 4.1) باستخدام فرشاة صغيرة تساعد على التقاط الخزعة. بعد نقل القسم إلى البئر الأول ، في كل مرة تحتاج فيها الشريحة إلى التحضين بمحلول مختلف ، انقلها من البئر إلى البئر بمساعدة الفرشاة.

فئة

5. التصوير المناعي الفلوري

1. عرض الأقسام تحت مجهر مضان مقلوب أو مجهر متحد البؤر (تكبير 20X أو 40x أو أعلى، استخدم إطارات متتالية بزيادات قدرها 2 ميكرومتر على خطة Z-stack للحصول على أفضل النتائج).
2. الحصول على الصور بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر
3. استخدم برنامج تصوير مناسب (مثل ImageJ) لتحليل الإشارات الإيجابية في الأقسام من حيث التوزيع المكاني وشدة الإشارة. للقيام بذلك ، قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أدناه.
   1. افتح الملف باستخدام برنامج ImageJ.
   2. انقر فوق صورة > لون > تقسيم القنوات لتحليل كل قناة لون.
   3. انقر فوق مشروع Image > stack > Z للحصول على دمج عمليات الاستحواذ على أقسام متعددة.
   4. انقر فوق صورة > لون > دمج القنوات للحصول على دمج قنوات الألوان المختلفة لنفس الاكتساب.

الجدول 1: الحلول المطلوبة. قائمة بالحلول المطلوبة للبروتوكول ووصف موجز لكيفية إعداده.

محلول مضاد للتجمد
(يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر) 30٪ جلسرين
30٪ إيثيلين جلايكول
30٪ dH₂O
10٪ 2x عازلة الفوسفات حجب الحل
(استعد في الوقت الحالي) 4٪ سيروم الماعز العادي
1٪ تريتون X-100
في محلول الغسيل حماية من التبريد
(يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر) 20٪ جلسرين
80٪ محلول سورنسن محلول فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم
(تخزينها في RT لمدة تصل إلى 6 أشهر) 0.45M فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na₂HPO4) في dH₂O
تصفية في زجاجة معقمة محلول اللايسين
(يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع) 50٪ من محلول أحادي هيدروكلوريد L-Lysine 0.3M
50٪ من محلول سورنسن 0.1 مليون درجة الحموضة 7.6
درجة الحموضة 7.4 ، مرشح في زجاجة معقمة بارافورمالدهيد (PFA) 8٪
(تحضير تحت غطاء الدخان وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد) 2.6M PFA في dH₂O (إلى 55 درجة C_do لا تتجاوز 60 درجة مئوية لتجنب تكوين حمض الفورميك)
تصفية في زجاجة معقمة عازلة الفوسفات 2x
(يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر) 6٪ محلول فوسفات أحادي الصوديوم (NaH₂PO₄)
محلول 45٪ فوسفات ثنائي الصوديوم (Na₂HPO₄) في dH₂O حل تثبيت PLP
(استعد في الوقت الحالي ، تحت غطاء الدخان) 25٪ بارافورمالدهيد 8٪
0.01 مليون صوديوم (ميتا) دوري
75٪ محلول ليسين فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم أحادي الهيدرات
(تخزينها في RT لمدة تصل إلى 6 أشهر) 0.52M أحادي هيدرات فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH₂PO₄ * H₂O) في dH₂O
يصفى في زجاجة معقمة. حل سورنسن
(يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد) 2.5٪ محلول فوسفات أحادي الصوديوم
18.7٪ محلول فوسفات ثنائي الصوديوم
الرقم الهيدروجيني 7.6 ، في dH₂O محلول الغسيل
(استعد في الوقت الحالي) 0.25 م قاعدة Trizma
0.26 م كلوريد الصوديوم
الرقم الهيدروجيني 7.6 ، في dH₂O حل العمل
(استعد في الوقت الحالي) 50٪ محلول حجب
محلول غسيل 50٪

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5G4 (مضاد للإنسان αSyneclein 5G4) Analytik جينا Roboscreen 847-0102004001 الماوس أحادي النسيلة AlexaFluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgG إنفيتروجين 1971418 2 ملغ / مل AlexaFluor 594 الماعز المضاد للفأر IgG إنفيتروجين 1922849 2 ملغ / مل محلول فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم ميرك ميليبور 106586 الإيثيلين جلايكول سيجما ألدريتش 324558 الجلسرين سيجما ألدريتش جي 7757 ل-يسين أحادي هيدروكلوريد سيجما ألدريتش L5626 بارافورمالدهيد ألدريتش كيمياء 441244 PGP9.5 أبكام أب15503 أرنب متعدد النسيلة كلوريد الصوديوم سيغما S3014 ثنائي هيدروجين فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات ميرك ميليبور 106346 دوريات الصوديوم (ميتا) سيجما ألدريتش S1878 قاعدة تريزما سيغما [ت1503] تريتون X-100 سيجما ألدريتش X100 فيكتاشيلد مختبرات ناقلات إتش -1000 تصاعد الوسط