استخدام التصوير المقطعي بوساطة التألق لتقييم التهاب الأمعاء الفئرانية

الملخص

المصدر: Nowacki، T. M.، et al. التصوير المقطعي بوساطة التألق للكشف عن التهاب الأمعاء الفئران المرتبط بالبلاعم وتقديره الكمي. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم تسلل البلاعم المعوية في نموذج الفئران لالتهاب القولون باستخدام التصوير المقطعي بوساطة التألق (FMT). عند إحداث التهاب القولون في الفأر عن طريق كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) ، يتم حقن بالأجسام المضادة التي تتعرف على علامة البروتين السكري F4 / 80 على البلاعم المتسللة في القولون. ثم يتم تصوير الماوس في جهاز FMT حيث يتم إعادة بناء إشارات التألق والانعكاس في صورة ثلاثية الأبعاد لتحديد التوزيع المكاني وشدة التألق.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. المواد والإعداد التجريبي

1. رعاية.
   1. استخدم الفئران المتطابقة مع الجنس والعمر من أي سلالة حساسة ل DSS (على سبيل المثال ، C57BL / 6) بوزن 20-25 جم من وزن الجسم.
   2. خطط لخمسة فئران على الأقل أو أكثر لكل مجموعة تجريبية وإيواء الفئران وفقا لإرشادات رعاية المحلية.
   3. توفير نظام غذائي قياسي لتناول القوارض ومياه الشرب المعقمة حسب الحرة.
   4. قم بإزالة الطعام القياسي واستبدله بالطعام الخالي من البرسيم قبل ثلاثة أيام على الأقل من المسح لتقليل التألق الذاتي الداخلي.
2. تحريض التهاب القولون الحاد الناجم عن DSS.
   1. قم بإذابة 2 جم من DSS (الوزن الجزيئي ~ 40،000 Da) في 100 مل من مياه الشرب المعقمة للحصول على 2٪ (وزن / حجم).
   2. املأ إمدادات الشرب من الفئران حصريا بمحلول DSS وقدر 5 مل من السائل لكل فأر يوميا. توفير نفس مياه الشرب بدون DSS للفئران الضابطة.
      ملاحظه: راقب الفئران يوميا حتى نهاية التجربة. قتل الفئران التي تفقد أكثر من 20٪ من وزن جسمها الأولي أو التي تحتضر (أي الوضعية المنحنية باستمرار ، وانخفاض الحركة ، وصعوبة التنفس ، والمعطف المنتصب بشكل ملحوظ) وفقا للإرشادات المحلية المعمول بها بشأن رعاية.
3. تحضير التصوير المقطعي بوساطة الفلورة.
   1. قم بتسمية الجسم المضاد المطلوب (على سبيل المثال ، الفئران المضادة للفأر F4 / 80) بصبغة مضان (على سبيل المثال ، السيانين 7 ،_{الإثارة} λ: 750 نانومتر ،_انبعاث λ: 776 نانومتر) كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. غسيل الكلى الأجسام المضادة المنقى في غشاء غسيل الكلى المناسب (حجم المسام < 50-100 كيلو دالتون) مقابل 1 لتر من 0.15 مولار كلوريد الصوديوم لمدة ساعتين على الأقل أو بين عشية وضحاها.
      1. انقل الجسم المضاد إلى 1 لتر من 0.1 M NaHCO₃ وقم بغسيل الكلى لمدة ساعتين على الأقل.
      2. قم بإذابة الكمية المطلوبة من صبغة الفلورسنت في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (10.8 ميكرولتر / مجم من الجسم المضاد) وإضافتها إلى محلول الجسم المضاد. استخدم صبغة الفلورسنت في زيادة مولار بمقدار 20 ضعفا لتحقيق نسبة صبغة إلى بروتين تبلغ 1: 3.
      3. احتضان في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. قم بإزالة الأجسام المضادة غير المسماة عن طريق غسيل الكلى ضد 1 لتر من 0.15 M صوديوم أو باستخدام عمود تحلية PD-10 وحلها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للتطبيق في الجسم الحي.
      4. تحديد تركيز الجسم المضاد النهائي ونسبة الملصقات عن طريق القياس الطيفي.
      5. قم بقياس تركيز البروتين عند امتصاص 250-330 نانومتر وفكر في امتصاص الصبغة الإضافي. قم بتصحيح الحد الأقصى للامتصاص عند 280 نانومتر (بروتين) بنسبة 11٪ من الحد الأقصى للامتصاص عند 750 نانومتر (الخطوة التالية) لوضع العلامات على السيانين.
      6. قم بقياس تخفيف المركب (عادة 1:10) عند 250-800 نانومتر واستخرج تركيز السيانين7 عند 750 نانومتر.
      7. حدد نسبة الصبغة إلى البروتين على النحو التالي: صبغة / جسم مضاد = أقصى امتصاص عند 750 نانومتر / 200,000 / (أقصى امتصاص عند 280 نانومتر - 0.11 × أقصى امتصاص عند 750 نانومتر) / 170,000.
      8. احتفظ بمحلول الأجسام المضادة عند 4 درجات مئوية وحمايته من الضوء لتجنب التبييض قبل الحقن.
   2. قم بتحميل حجم محلول الجسم المضاد اللازم في حقنة معقمة مباشرة قبل الحقن وحمايته من الضوء حتى يتم استخدامه.
   3. تحديد التوقيت الأمثل لحقن المسبار وإجراء المسح ، اعتمادا على الحركية الدوائية للتتبع.
   4. قم بتخدير الفئران باستخدام 1.5 - 2.5٪ من الأيزوفلوران المستنشق في الأكسجين أو ضعها بإحكام في مصفاة مخصصة لحقن الأجسام المضادة المصنفة في وريد الذيل.
   5. بالنسبة للأجسام المضادة كاملة الطول ، قم بحقن الجسم المضاد المسمى قبل 24 ساعة على الأقل من المسح ، مثل تصور البلاعم المضاد للفأر F4 / 80 في التهاب القولون الفئراني. حقن الفئران عن طريق الوريد (IV) عبر وريد الذيل بجسم مضاد مصنف بكمية تعادل 2.0 نانومول من الصبغة.
   6. استخدم الأجسام المضادة غير المحددة ذات العلامات المتساوية (على سبيل المثال ، الفئران IgG أو أي نمط إسوي آخر يتوافق مع تراث الجسم المضاد الأساسي) كعنصر تحكم في النمط الإسوائي بجرعات مكافئة لتلك الخاصة بالمسبار المحدد.
      ملاحظه: يمكن أن تكون نتائج عمليات المسح في الجسم الحي بعد حقن مركب التحكم بمثابة مرجع لتفسير بيانات تصوير المسبار المحددة.
   7. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلاقة فرو في منطقة البطن لتقليل انعكاس الضوء وامتصاصه.

فئة < p = "jove_title" >2. المعدات التقنية

1. استخدم جهاز التصوير المقطعي بوساطة التألق البيطري (FMT) لمضان الصغيرة (الشكل 1).
2. قم بإنشاء دراسة جديدة لكل مشروع بالنقر فوق الزر "دراسة جديدة" وقم بتضمين أدوات التتبع ذات الصلة في وصف الدراسة ، بما في ذلك معلمات التصوير والجرعات للرجوع إليها في المستقبل.
3. ضمن هذه الدراسة، قم بإنشاء لجان دراسة وفقا لتصميم الدراسة المعني (على سبيل المثال، لتتبع محدد وعنصر تحكم النمط المتماثل غير المحدد) بالنقر فوق الزر "مجموعة دراسة جديدة". تجهيز كل مجموعة دراسة بالعدد المتعلق بالحيوانات.
4. معايرة النظام لتركيبات التتبع.
   1. قم بإجراء المعايرة لكل دفعة من أدوات التتبع لتطبيع التباين في الملصقات وتمكين القياس الكمي من بيانات OI.
   2. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للجهاز لمعايرة كل نظام على حدة ؛ عند اختيار "إضافة متتبع جديد" ، سيوفر النظام دليلا عبر الخطوات. توفير تخفيف محلول الجسم المضاد المطبق والتركيز المطلق المحسوب للمتتبع في المسبار.
   3. بالنسبة إلى FMT ، استخدم شبحا يحاكي الأنسجة بسماكة محددة وخصائص امتصاص (تشبه الأنسجة الحيوية) واملأه بحجم معين من محلول الجسم المضاد المستخدم. قم بقياس هذا على جهاز FMT.
      ملاحظه: سيستخدم النظام القياس المرجعي للمسبار المقدم، جنبا إلى جنب مع التركيز المحدد، لحساب تركيزات التتبع المطلقة من القياسات المستقبلية في الجسم الحي.
5. استخدم كاسيت فحص قابل للتسخين بدرجة حرارة 42 درجة مئوية
   ملاحظه: هذا يمنع الفئران من أن تصبح منخفضة حرارة الجسم أثناء الفحص.

< ص الفئة = "jove_title" >3. التخدير الحيواني

1. استخدم تدفقا مستمرا من 1.5 - 2٪ حجم ٪ إيزوفلوران ([2-chloro-2- (ثنائي فلوروميثوكسي) -1،1،1-ثلاثي فلورو إيثان]) و 1.5 لتر O₂ / دقيقة لتخدير الفئران. استخدم أنظمة استنشاق مصممة خصيصا لتخدير القوارض (مبخر الأيزوفلوران) للتحكم بسهولة في عمق التخدير وتقليل تعرض الموظفين.
2. ضع الماوس في حجرة الحث المانعة للتسرب وقم بتشغيل المرذاذ لإمداد الأيزوفلوران (100٪ (حجم / حجم) ، 5٪ فولت٪ في الأكسجين ، 3 لتر / دقيقة). راقب الماوس حتى يصبح مستلقيا وفاقدا للوعي.
3. ضعه في شريط الفحص للتصوير المقطعي ، مع استنشاق مستمر للإيزوفلوران عبر مخروط الأنف بجرعة 100٪ حجم / حجم ، 1.5٪ حجم في الأكسجين ، 1.5 لتر / دقيقة لتقليل القطع الأثرية للحركة أثناء الفحص. للإجراءات التي تستمر لأكثر من 5 دقائق ، ضع مرهم العين على عيون الفأر لمنع تلف القرنية.
4. تقييم عمق التخدير عن طريق فحص ردود الفعل. ضع الماوس على ظهره. إذا كان التخدير كافيا ، فلا ينبغي أن يستدير الفأر. اضغط على الماوس بهدوء بين أصابع قدميه. إذا كان التخدير كافيا ، فلن يتم سحب الساق (مرحلة التحمل الجراحي).

< p class = "jove_title" >4. مسح التصوير المقطعي بوساطة التألق

ملاحظة: قم بتكييف التفاصيل التالية ، الخاصة بنظام FMT المستخدم في هذه الدراسة (انظر جدول المواد) لأجهزة التصوير الانعكاس الفلوري البديلة أو أنظمة FMT ، حسب الحاجة.

1. ضع الفأر المخدر على ظهره في شريط الفحص.
2. قم بإجراء المسح.
   1. أدخل الكاسيت في نظام التصوير وأغلقه على الفور لضمان التخدير المستمر. حدد العينة المناسبة من لجنة الدراسة التي تم إنشاؤها مسبقا. حدد أداة التتبع التي تمت إدارتها من القائمة المنسدلة للتأكد من حساب قيم تركيز التتبع بشكل صحيح.
   2. احصل على صورة انعكاس مضان بالطول الموجي المناسب (720 نانومتر ل Cyanine7) لتخطيط المسح وحدد حقل المسح بالنقر فوق الزر "الحصول على صورة".
   3. لاحظ أن حقل المسح يظهر كتراكب على صورة انعكاس الفلورة. اضبطه وفقا لمنطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، القولون أو البطن) ، وتجنب الهواء أو مناطق الفراء المتبقية. اعتمادا على هدف الصورة، قم بتعيين عدد نقاط بيانات الصورة داخل حقل المسح الضوئي عن طريق الاختيار من بين دقة حقل المسح الخشن إلى المتوسط والدقيقة في القائمة الموجودة على اليمين.
      ملاحظه: ضع في اعتبارك أن حقل المسح الدقيق قد يوفر دقة مكانية أفضل على حساب وقت مسح أطول بكثير.
   4. ابدأ الحصول على البيانات / الصور بالطول الموجي المحدد بالنقر فوق "scan."
      ملاحظه: سيكون وقت الفحص لإجراء فحص متوسط الدقة للبطن بالكامل حوالي 5 دقائق. في هذا الوقت ، تضيء كل نقطة بيانات بشكل منفصل بواسطة ليزر الإثارة ، ويتم تسجيل التألق الناتج.
   5. قم بإزالة من كاسيت التصوير في نهاية الفحص واسمح للحيوان بالتعافي تماما قبل إعادته إلى القفص.
   6. كرر FMT إذا لزم الأمر في نقاط زمنية مختلفة أثناء التجربة (على سبيل المثال ، الأيام 0 و 5 و 9 - 10 (نهاية التجربة)) ، ولكن ضع في اعتبارك تراكم الأجسام المضادة في الجسم ، وبالتالي زيادة إشارة مضان الخلفية.

< p class = "jove_title" >5. إعادة بناء البيانات وتفسيرها

1. استخدم أداة إعادة البناء الخاصة ببرنامج التصوير المعني لإنشاء خرائط ثلاثية الأبعاد لتوزيع التألق من بيانات التصوير الأولية ؛ تتم إضافة عمليات المسح تلقائيا إلى أداة إعادة البناء عند المسح ، يتم تحديد وظيفة "إضافة إلى قائمة انتظار إعادة البناء" عند المسح.
   1. بخلاف ذلك، حدد عمليات المسح الضوئي من القائمة المنسدلة ضمن مجموعة الدراسة والدراسة المعنية، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المسح الضوئي، وحدد "إضافة إلى إعادة البناء".
2. لمزيد من التحليل ، قم بتحميل مجموعة بيانات في برنامج التحليل. من القائمة المنسدلة في الشريط العلوي ، حدد الدراسة المعنية ثم حدد مجموعة الدراسة الفردي من القائمة الموجودة على اليمين ؛ سيتم عرض جميع عمليات المسح التي تم إجراؤها لهذا. حدد الفحص الصحيح وانقر فوق "تحميل".
   ملاحظه: ستظهر إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لتوزيع التتبع على اليسار كتراكب لصورة انعكاس التألق المكتسبة في البداية. يمكن تدوير النموذج وتكبيره لتسهيل التحليل.
3. تحديد بؤر تراكم الملصقات غير المحدد (على سبيل المثال ، الكبد أو المثانة البولية) على الخرائط ثلاثية الأبعاد المعاد بناؤها والتمييز بينها وبين الأنسجة المستهدفة (مثل الأمعاء أو الأمعاء).
4. من الشريط العلوي، حدد شكل عائد الاستثمار الأنسب للهدف. تسمية الأنسجة المستهدفة كمناطق ذات أهمية (ROI) عن طريق وضع أدوات القياس ذات الصلة في برنامج التحليل ؛ سيوفر البرنامج شدة مضان لعائد الاستثمار ، بالإضافة إلى كميات (بيكو-) مولية من التتبع الذي تمت معايرة المسح من أجله.
5. حدد المبلغ الإجمالي للمتتبع في عائد الاستثمار المناسب ، الذي تم تطبيعه لحجم عائد الاستثمار ، باعتباره المكافئ الأنسب لتقييم نشاط المرض بالارتباط بالتسلل الالتهابي (الأنسجة).
   ملاحظه: يمكن اختيار ميزات أخرى لعائد الاستثمار إذا كان ذلك مناسبا كممثل لنموذج معين.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. التصور المقطعي للبلاعم يتسلل في التهاب القولون الفئران.

فحوصات FMT في الفئران المصابة بالمغنج والضوابط غير القولونية التي أعطت الأجسام المضادة المترافقة مع السيانين 7 ضد الفئران F4 / 80 (ن = 5 لكل مجموعة). (أ) الرسم البياني الشريطي: تم تحديد شدة التألق الإجمالية في PMOL للصبغة في عائد الاستثمار وتم تصويرها ± SEM. تظهر الصور...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف نظام غذائي خال من البرسيم Harlan Laboritories، ماديسون، الولايات المتحدة الأمريكية 2014 مرهم العين Bepanthen باير ، ليفركوزن ، ألمانيا 80469764 ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS) TdB Consulatancy ، أوبسالا ، السويد دب 001 إيوسين سيجما - ألدريتش ، دايزنهوفن ، ألمانيا ه 4382 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سيجما - ألدريتش ، دايزنهوفن ، ألمانيا إي 9884 فلورين 100 فولت / فولت أبوت ، فيسبادن ، ألمانيا ب 506 الهيماتوكسيلين سيجما - ألدريتش ، دايزنهوفن ، ألمانيا HHS32-1L O.C.T. مركب الأنسجة تيك ساكورا ، Zoeterwonde ، هولندا 4583 مثبت للتحليلات النسيجية محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS لونزا ، فيرفييه ، بلجيكا 4629 كلوريد الصوديوم 0,9٪ براون ، ميلسونجن ، ألمانيا 5/12211095/0411 مسحوق بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش دايزنهوفن ، ألمانيا الطراز S5761 النظام الغذائي القياسي ألترومين ، لاجي ، ألمانيا 1320 الأنسجة تيك كريومولد ساكورا ، ليدن ، هولندا 4566 Hemoccult (اختبار ورقة guaiac) بيكمان كولتر ، ألمانيا 3060 البيوتين الفئران المضادة للفئران المضادة للجسم المضاد F4 / 80 سيروتيك ، أكسفورد ، المملكة المتحدة MCA497B البيوتين الفئران المضادة للفئران المضادة ل GR-1 BD Pharmingen ، هايدلبرغ ألمانيا 553125 ستربتافيدين - أليكسا 546 المجسات الجزيئية ، دارمشتات ، ألمانيا إس -11225 الحد الأقصى للإثارة / الانبعاث: 556/573 نانومتر الأجسام المضادة للفئران المضادة للفئران المضادة TC Calteg ، Burlingame ، الولايات المتحدة الأمريكية R2b06 الجسم المضاد F4 / 80 المنقى المضاد للفأر BioLegend ، لندن ، المملكة المتحدة 123102 دابي سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا د9542 الأجسام المضادة للفئران المضادة ل Ly6C المترافقة FITC BD Pharmingen ، هايدلبرغ ، ألمانيا 553104 مخزن FACS المؤقت BD Pharmingen ، هايدلبرغ ، ألمانيا 342003 Cy7 NHS إستر جنرال إلكتريك للرعاية الصحية في أوروبا ، فرايبورغ ، ألمانيا PA17104 MPO ELISA Immundiagnostik AG ، بنشيم ، ألمانيا ك 6631 ب Cy5.5 يسمى الجسم المضاد F4 / 80 المضاد للفأر BioLegend ، لندن ، المملكة المتحدة 123127 جاهز للاستخدام الأجسام المضادة الموسومة (بديل) مضاد للفأر F4 / 80 مستضد PerCP-Cyanine5.5 eBioscience, Waltham, الولايات المتحدة الأمريكية 45-4801-80 جاهز للاستخدام الأجسام المضادة الموسومة (بديل) DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا 67-68-5 إيزوفلوران سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا 792632 ايثانول سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا 64-17-5 ألبومينات مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا أ 4612 محلول ملحي مخزن في تريس (TBS) سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا SRE0032 معدات نظام قياس التدفق الخلوي FACS Calibur BD Biosciences GmbH ، هايدلبرغ ، ألمانيا FMT 2000 في نظام التصوير في الجسم الحي شركة PerkinElmer Inc. ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية FMT2000 برنامج تحليل التصوير True Quant 3.1 شركة PerkinElmer Inc. ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية مدرجة في FMT2000 مجهر الفلورسنت Leica DMLB لايكا ، 35578 فيتزلار ، ألمانيا DMLB بانديلين سونوبولس HD 2070 بانديلين ، 12207 برلين ، ألمانيا اتش دي 2070 الخالط بالموجات فوق الصوتية مشرط يمكن التخلص منه رقم 10 سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا Z692395-10 أ مقص ميتزنباوم 14 سم Ehrhardt Medizinprodukte GmbH ، Geislingen ، ألمانيا 22398330 حقنة قفل لور 5 مل سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا Z248010 إبر الحقنة سيجما ألدريتش ، ديزنهوفن ، ألمانيا Z192368 أنبوب فالكون 50 مل BD Biosciences ، Erembodegem ، بلجيكا 352070