الكشف القائم على مصفوفة الببتيد للأجسام المضادة ل HLA المضادة للمتبرعين في متلقي الأعضاء

الملخص

المصدر: Liu، P.، et al. مصفوفات الببتيد الشخصية للكشف عن الأجسام المضادة ل HLA في زراعة الأعضاء. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو اختبارا للكشف عن الأجسام المضادة ل HLA المضادة للمتبرعين في متلقي الأعضاء. يتم تصنيع مصفوفة الببتيد لتمثيل الحلقات المحتملة لرفض الأعضاء بوساطة الأجسام المضادة. يتم تحضين المصفوفة بمصل المتلقي ، الذي يحتوي على أجسام مضادة مرتبطة بحواتم مستهدفة. يتم الكشف عن ارتباط الأجسام المضادة باستخدام التلألؤ الكيميائي لتحديد حواتم HLA الخاصة بالمتبرع والتي تحرض على تفاعل الأجسام المضادة الخيفية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تصميم تخطيط المصفوفة المخصصة والإنتاج

1. قم بإنشاء جدول بيانات لتسلسلات الببتيد مع نداءات الأليل المقابلة. تحتوي المصفوفة على 20 صفا و 30 عمودا ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 20 × 30 = 600 نقطة للببتيدات. اعتمادا على العدد الإجمالي للببتيدات المسجلة في الخطوة 1.5 من متبرع معين ، وبناء على تجربتنا السابقة مع مثالين جربناهما ، يمكن لمصفوفة 600 Spot أن تحتوي على جميع التسلسلات التي تم إنشاؤها من ~ 2 حالات زرع منفصلة.
   1. خطط بعقلانية للطريقة الأكثر فاعلية لتناسب مجموعات الببتيدات ضمن تنسيق 600 نقطة للمصفوفة.
   2. إذا كان يمكن أن يتسع أكثر من موضوع واحد في مصفوفة واحدة كاملة ، فقم بإدراج صفوف فارغة بعد تسلسلات المتبرع الأول لمطابقة العدد الإجمالي للصفوف التي يمكن تقسيمها على 30 (عدد النقاط في صف واحد على المصفوفة).
   3. مباشرة بعد الصف الفارغ الأخير للمجموعة الأولى من التسلسلات ، الصق العمود الكامل لمحتويات التسلسل من حالة الزرع الثانية.
   4. كرر هذه الخطوات حتى يتم ملء المصفوفة ولا يمكن إضافة المزيد من الحالات دون تجاوز 600 نقطة. إذا تركت الصفوف الفارغة بالكامل لملئها في الأسفل ، "حرك" الصف الفارغ ليتم وضعه بين مجموعتي المتبرعين. هذه المساحة الواسعة المتبقية بين الحالات تجعل قطع الغشاء بعد الانتهاء من التوليف أسهل - باتباع الخطوة 2.2. ادناه.
2. قم ببرمجة تسلسلات الببتيد في سياق تخطيط المصفوفة. يأخذ برنامج مركب SPOT تنسيقا نصيا للتسلسلات (صف واحد ، تسلسل ببتيد واحد) ، والذي يمكن الحصول عليه مباشرة عن طريق حفظ جدول البيانات الناتج من الخطوة 1.1.4 كمستند نصي بسيط (بدون العمود (الأعمدة) الإضافية لأسماء الأليل ، مواضع aa وما إلى ذلك).
3. قم بتشغيل توليف مصفوفة الببتيد الآلي عبر مركب SPOT. تم تفصيل عملية التوليف بأكملها في Kudithipudi et al. لاحظ أن تخليق Fmoc لمصفوفتين يستغرق ~ 4-5 أيام.

< p class = "jove_title" >2. فحص وإعادة فحص مضاد المصل من سلسلة زمنية لمتلقي الزرع الفردي.

فئة

ملاحظة: تتميز مصفوفة الغشاء المكونة من 600 نقطة بأبعاد ~ 7 سم × 13 سم. بعد التوليف ، يمكن تخزين المصفوفات في درجة حرارة الغرفة كأغشية جافة لمدة عامين على الأقل عند حمايتها من الضوء المباشر. تجنب الطي المفرط للغشاء للحفاظ على طول عمره للاستخدام المتكرر.

1. أعد ترطيب مجموعة الأغشية بالإيثانول وتصور بقع الببتيد الملطخة ب Ponceau S.
   1. أعد ترطيب المصفوفة الغشائية التي تحمل الببتيدات باتباع إجراء تدريجي محسن في Li et al.
      1. اغمر غشاء المصفوفة في 20 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
      2. أضف 20 مل من الماء المقطر لتخفيف المحلول إلى 50٪ من الإيثانول واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      3. قم بتغيير محلول الغمر إلى 40 مل من الماء بنسبة 100٪ ثلاث مرات واحتضانه لمدة 15 دقيقة في كل مرة.
      4. يغسل في مخزن مؤقت مناسب ، على سبيل المثال ، 20 مل من TBST (محلول ملحي مخزن بمقدار 0.1٪) ، ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   2. تلطيخ Ponceau S للمصفوفة لتصور الببتيدات الاصطناعية
      1. أضف 20 مل من محلول Ponceau S المجهز مسبقا مباشرة إلى المصفوفة الرطبة واحتضنه لمدة ~ 30 ثانية مع الرج.
      2. قم بتشغيل الماء المقطر باستمرار فوق الغشاء لإزالة بقع لون Ponceau S في الخلفية. أثناء العملية ، قد تصبح بقع الببتيد ذات اللون الأحمر مرئية.
      3. افصل أجزاء المصفوفة لكل متبرع عن طريق القطع بعناية بين أقسام المصفوفة للحالات الفردية. حدد اتجاه كل صفيف.
2. مصفوفة ما قبل الكتلة.
   1. سد الغشاء في 20 مل من الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ المذاب في عازلة TBST. سيعمل هذا المحلول القائم على الحليب على إزالة بقع لون Ponceau S. استبدل عازلة الحليب عدة مرات للحصول على أوضح صور الببتيد.
   2. لأغراض حفظ السجلات ، التقط صورة لصورة Ponceau S للمصفوفة باستخدام كاميرا محمولة باليد (مثال في الشكل 1).
   3. استمر في سد الغشاء في 5٪ حليب خالي الدسم عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مع الهزاز.
3. احتضان المصفوفة مع مصل الزرع.< / > ملاحظه: وتجدر الإشارة إلى أن ظاهرة تعرف باسم البروزون أو تأثير الخطاف قد تنتج عن التداخل المعتمد على المكمل في تحليل الأجسام المضادة في المصل. للتحايل على هذه المشكلة ، يمكن النظر في خطوة اختيارية للمعالجة المسبقة للمصل إما بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) أو التعطيل الحراري لعينات المصل.
   1. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع واغسل الغشاء ب 20 مل من TBST ثلاث مرات في اليوم التالي لمدة 5 دقائق في كل مرة.
   2. أضف 20 ميكرولتر من المصل الخام للمتلقي إلى 20 مل من الحليب بنسبة 2.5٪ في محلول TBST واحتضانه بالغشاء لمدة 2-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه في هذه الجولة الأولية من الفحص ، يوصى باستخدام مصل ما بعد الزرع الأخير (أو من المحتمل أن يكون المصل الأكثر حساسية) في السلسلة الزمنية لأول مرة. يعتمد هذا على افتراض أن العينات السابقة في السلسلة ، خاصة من النقاط الزمنية قبل الزرع ، تحتوي على مجموعة أقل من الأجسام المضادة التي تميل إلى التطور بمرور الوقت. بهذه الطريقة ، يمكن تمييز أي احتمال لتداخل الإشارة من "الترحيل" بين جولات الفحص بوضوح عن تفاعل الجسم المضاد المطور حقا بسبب الاستجابات المناعية ضد الكسب غير المشروع.
4. اغسل المصفوفة باستخدام 20 مل من TBST واحتضانها بجسم مضاد ثانوي.
   1. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.
   2. احتضان الجسم المضاد الثانوي IgG-HRP المضاد للإنسان (بيروكسيداز الفجل الحصري) عند تخفيف 1: 10,000 في مخزن TBST المكمل بحليب 1٪ لمدة ساعتين أخريين.
5. اغسل وطور البقعة.
   1. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق في كل مرة.
   2. إجراء التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) باستخدام 5 مل من محلول اللومينول الممزوج حديثا مع 5 مل من محلول البيروكسيد لتطوير الغشاء (لمدة 1 دقيقة).
   3. تصور إشارات ECL باستخدام جهاز تصوير مناسب (على سبيل المثال، ChemiDoc Imaging Systems أو Azure C600).
6. مسح وصمة اللطخة.
   1. احفظ الصور المطورة (الشكل 2 ، الصورة السفلية) وقم بإجراء القياس الكمي لكثافة البقعة.

< p class = "jove_title" >3. قارن تفاعل المصل المضاد عبر سلسلة زمنية سريرية.

1. قم بتجريد المصفوفة.
   1. في هذه المرحلة ، حافظ على الغشاء رطبا في جميع الأوقات.
   2. قم بتجريد الغشاء عن طريق احتضانه ب 20 مل من المخزن المؤقت للتجريد التجاري عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم اغسل الغشاء باستخدام TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. ثم كرر خطوات الحظر (الخطوة 3.2) والفحص (الخطوة 3.3) باستخدام مصل مختلف للمريض تم أخذه في نقطة زمنية مختلفة.
2. كتلة الغشاء المجردة.< / > ملاحظة: بعد التجريد ، يمكن إعادة استخدام الغشاء لجولة أخرى من فحص مصل مختلف من نفس المريض في سلسلة زمنية.
   1. سد الغشاء باستخدام محلول الحليب بنسبة 5٪ كما كان من قبل (انظر الخطوة 2.2).
3. استنبذ مصل مختلف من نفس السلسلة الزمنية (كرر الخطوات من 2.3-2.6 ؛ مثال في الشكل 2 ، الصورة العلوية).
   ملاحظه: يمكن بعد ذلك استخدام المصفوفة المجردة لإعادة اكتشاف عينة مصل أخرى. نظرا لأن الببتيدات مترافقة تساهميا مع المصفوفة الداعمة للغشاء ، فقد أظهرنا أنه يمكن إعادة استخدام المصفوفة لمدة تصل إلى 20 جولة من دورات التجريد والتكرار دون أن تفقد أدائها.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. صورة لقسم مصفوفة ملطخ ب Ponceau S

< p class = "jove_content" >لاحظ أن التباين في كثافة اللون يرجع إلى الاختلافات في تكوين الأحماض الأمينية بين الببتيدات ، في حين أن تركيزات الببتيد بين جميع مناطق البقعة هي نفسها. (الصورة هي مثال توضيحي ، وليست تلك الموجودة في هذه الدراسة الفعلية.) < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجموعة الببتيد أدوات التحليل الحيوي INTAVIS ايثانول سيجما ألدريتش E7023 حل Ponceau S سيجما ألدريتش P7170 حليب خالي الدسم مختبرات بيو راد 1706404 TBST سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية 10711454001 الماعز المضاد للإنسان IgG-HRP ثيرموفيشر العلمي أ 18811 الركيزة الشفافية الغربية ECL مختبرات بيو راد 1705061 استعادة المخزن المؤقت لتجريد اللطخة الغربية العلوم الحرارية هاتف 21059 نظام التصوير الجل ChemiDoc مختبرات بيو راد 1708265